Molekulargenetische Mutationsanalyse des APC-Gens mittels DHPLC bei Patienten mit Familiärer Adenomatöser Polyposis (FAP):
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Berlin
TENEA
2004
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS A
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN D
AMINOSÄURECODIERUNG F
VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN G
VERZEICHNIS DER TABELLEN L
I EINLEITUNG
1.1 Das Colorectale Carcinom (CRC) Epidemiologie 1
1.1.1 Die Familiäre Adenomatöse Polyposis (FAP) eine erbliche 2
Prädisposition für die Entstehung Colorectaler Carcinome (CRC)
1.1.2 Klinische Aspekte der FAP 2
1.1.3 Therapeutische Aspekte bei FAP 5
1.1.4 Genetische Aspekte der FAP 6
1.2 DasAPC Gen 7
1.2.1 Struktur des APC Proteins 8
1.2.2 Funktion des APC Proteins 10
1.2.3 Mutationen im APC Gen bei Patienten mit FAP 12
1.3 Mutationen auf DNA Ebene 14
1.4 Techniken zur Analyse von Sequenzvariationen (Mutationen) 15
II ZIELSTELLUNG
III MATERIAL UND METHODEN
3.1 Material 19
3.1.1 Zusammensetzung des untersuchten Patientenkollektivs 19
3.1.2 Technische Geräte und Hilfsmittel 19
3.1.3 Allgemeine Reagenzien, Puffer und Stammlösungen 21
3.1.4 Standards und Farbstoffe 22
3.1.5 Enzyme 22
3.1.6 Kommerzielle Kits 22
3.1.7 Primer 22
B Inhaltsverzeichnis
3.2 Methoden 27
3.2.1 Erhebung der klinischen Daten 27
3.2.2 Molekulargenetische Methoden 27
3.2.2.1 Isolierung genomischer DNA aus Vollblut 27
3.2.2.2 Konzentrationsbestimmung der DNA 28
3.2.2.3 DNA Amplifikation mittels Polymerase Kettenreaktion (PCR) 29
3.2.2.4 PCR Ansatz 30
3.2.2.5 PCR Reaktion 31
3.2.2.6 Auftrennung der DNA in Agarosegelen 32
3.2.2.7 Die DHPLC Analyse 33
3.2.2.7.1 Prinzip der DHPLC 33
3.2.2.7.2 Mutationsscreening mittels DHPLC 34
3.2.2.7.3 Analyse mit dem Wave® System 37
3.2.2.8 Reinigung der PCR Produkte 39
3.2.2.9 Die Sequenzierung 39
3.2.2.9.1 Prinzip der Sequenzierung 39
3.2.2.9.2 Sequenzieransatz 40
3.2.2.9.3 Sequenzierreaktion 41
3.2.2.9.4 Reinigung der Sequenzierprodukte (Fällung) 41
3.2.2.9.5 Sequenzierung mittels PAGE 42
3.2.2.9.6 Sequenzanalyse 44
3.2.2.10 Pooluntersuchungen 44
IV ERGEBNISSE
4.1 Auswertung des untersuchten Patientenkollektivs 47
4.2 Molekulargenetische Untersuchungen 48
4.2.1 Quantität und Qualität der isolierten DNA 48
4.2.2 Spezifität und Ausbeute der PCR Produkte 48
4.2.3 Optimierung der PCR 49
4.2.3.1 Annealingtemperatur 49
4.2.3.2 Magnesium Ionen Konzentration 51
4.2.3.3 Primerkonzentration 51
4.2.3.4 Optimierte PCR Protokolle 52
4.2.4 Optimierung der DHPLC 56
4.2.4.1 Schmelztemperatur 56
4.2.4.2 Pufferkonzentrationen 57
4.2.4.3 Optimierte DHPLC Parameter 59
4.2.5 Positivkontrollen 60
4.2.6 Fragmentanalyse 60
4.2.7 Sequenzanalyse 60
4.2.7.1 Einzelkasuistiken 63
Inhaltsverzeichnis C
V DISKUSSION
5.1 Zielstellung 65
5.2 Methoden 66
5.2.1 Polymerase Kettenreaktion (PCR) 66
5.2.2 Denaturierende Hochdruck Flüssigkeitschromatographie (DHPLC) 68
5.2.3 Sequenzierreaktion und automatische Sequenzierung mittels PAGE 73
5.3 Mutationen 74
5.3.1 Frameshift Mutationen 74
5.3.2 Nonsense Mutationen 74
5.3.3 Spleiß Mutationen 75
5.3.4 Missense Mutationen 76
5.3.4.1 E1317Q 76
5.3.4.2 D1822V 76
5.3.4.3 Pooluntersuchung zu D1822V 78
5.4 Polymorphismen 79
5.4.1 Poly A Trakt 79
5.4.2 Bekannte Single Nukleotid Polymorphimen (SNPs) 80
5.4.3 Bisher nicht beschriebene Normvarianten / Polymorphismen 81
5.4.3.1 IVS8 + 30A G 81
5.4.3.2 IVS13 + 78A G 81
5.4.3.3 Y935Y 81
5.4.3.4 Pooluntersuchung zu nicht beschriebenen Normvarianten 82
5.5 Genotyp Phänotyp Analyse 85
5.5.1 Klinische Angaben 85
5.5.2 Polyposis coli 86
5.5.3 Congenitale Hypertrophie des retinalen Pigmentepithels (CHRPE) 87
5.5.4 Seltene extracolonische Manifestationen 88
5.5.5 Patienten ohne krankheitsrelevante Mutation im APC Gen 91
5.6 Ausblick 93
5.6.1 Genetische Grundlagen 93
5.6.2 Genetische Studien 93
5.6.3 Technische Verfahren 94
5.6.4 Klinische Studien 94
VI ZUSAMMENFASSUNG 95
VII LITERATURVERZEICHNIS
VIII ANHANG (Abbildungen und Tabellen)
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