Analytik von Verbindungen des Purinstoffwechsels zur Charakterisierung des Protein- und Zellturnovers beim Schwein:
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2002
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| adam_text | Titel: Analytik von Verbindungen des Purinstoffwechsels zur Charakterisierung des Protein- und Zellturnover
Autor: Sonntag, Susanne
Jahr: 2002
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG.................................................................................................................1
2 LITERATURÜBERSICHT.............................................................................................2
2.1 Stickstoff (N)-Ausscheidung bei Nutztieren am Beispiel Schwein..................2
2.1.1 Problematik der N-Ausscheidungen...................................................................2
2.1.2 Herkunft und Ausscheidung der N-Verbindungen..............................................2
2.1.3 Maßnahmen der Tierernährung zur Reduktion der N-Ausscheidung.................3
2.2 Physiologische Hintergründe von Turnoverphänomenen................................5
2.2.1 Wachstumsphasen und Tumover......................................................................5
2.2.2 Biologischer Sinn von Tumoverphänomenen.....................................................7
2.2.3 Ausmaß von Tumovervorgängen in verschiedenen Geweben...........................8
2.2.3.1 Ausmaß des Proteinturnovers in verschiedenen Geweben beim Schwein .. 8
2.2.3.1.1 Probleme bei der quantitativen Bestimmung von Proteinumsatzzahlen
und des Turnovers.................................................................................10
2.2.3.1.2 Fraktionelle Proteinsyntheseraten (FSR) in verschiedenen Geweben
beim Schwein.........................................................................................13
2.2.3.2 Ausmaß des Zelltumovers in verschiedenen Geweben und Prinzipien der
Regeneration..............................................................................................14
2.2.4 Aspekte der Regulation des Tumovers............................................................16
2.2.4.1 Wesentliche hormonale Steuerungsmechanismen....................................16
2.2.4.2 Zelluläre Aspekte und Dialog zwischen Mitose und Apoptose...................19
2.2.5 Abbauprozesse und Wiederverwertung (Recycling).........................................21
2.3 Charakterisierung des Purin- und Nucleotidstoffwechsels............................23
2.3.1 Nomenklatur.....................................................................................................23
2.3.2 Biologische Funktionen....................................................................................24
2.3.3 Biosynthese der Purinnucleotide (de novo-Synthese)......................................25
2.3.4 Abbau und Verdauung der Purin-Verbindungen..............................................26
2.3.5 üteraturDbersicht zu Allantoirt-Messungen in biologischen Proben.................30
2.3.6 Befunde zu DNA- und RNA-Gehalten in verschiedenen Geweben..................31
2.3.7 Resorption und Transport von Nucleosiden und Nucleobasen........................35
2.3.8 Recycling von Purinverbindungen (.Salvage Pathway )...................................36
2.3.9 Verhältnis von de novo-Synthese und Salvage-Pathway.................................37
2.3.10 Sonderstellung des Darmes.............................................................................38
2.3.11 Zusammenfassende Übersicht über den Nucleotidstoffwechsel......................39
2.4 Ableitung von Markem zur Charakterisierung des Protein- und Zellturn-
overs beim Schwein...........................................................................................40
2.4.1 Allantoin............................................................................................................40
2.4.2 Nucleinsäuren..................................................................................................41
2.4.2.1 Desoxyribonucleinsäure (DNA)..................................................................41
2.4.2.2 Ribonucleinsäure (RNA).............................................................................42
3 ZIELSETZUNG...........................................................................................................43
4 MATERIAL UND METHODEN....................................................................................44
4.1 Tierversuche.......................................................................................................44
4.1.1 Versuchstiere...................................................................................................44
4.1.2 Haltung und Fütterung......................................................................................46
4.1.3 Versuchsaufbau und Probenahme...................................................................48
4.1.3.1 24 h-Profile zur Ermittlung der Beziehung zwischen Allantoin- und
Cortisolkonzentrationen im Blut im diurnalen Verlauf ...................48
4.1.3.2 ACTH-Infusion............................................................................................48
4.1.3.3 Testosteron-Infusion...................................................................................49
4.1.3.4 Versuch Gewebetiere: Nutritive Einflüsse..................................................49
4.1.3.5 Versuch Rassenvergleich...........................................................................50
4.1.3.6 Gewebeproben entlang des Dünndarms....................................................51
4.1.4 Probenahmetechnik.........................................................................................51
4.1.4.1 Probenahme von Blut.................................................................................51
4.1.4.2 Probenahme von Geweben........................................................................52
4.1.4.2.1 Probenahme von Geweben bei individueller Einschläferung der Tiere.. 52
4.1.4.2.2 Probenahme von Geweben im Rahmen der Schlachtung.....................53
4.2 Chemikalien und Geräte.....................................................................................54
4.2.1 Chemikalien......................................................................................................54
4.2.2 Geräte..............................................................................................................54
4.3 HPLC-Bestimmung von Allantoin im Blutplasma mit Vorsäulenderivatisie-
rung......................................................................................................................55
4.3.1 Chemikalien......................................................................................................55
4.3.2 Lösungen..........................................................................................................56
4.3.3 Durchführung...................................... ....56
4.3.3.1 ProteinfäJlung.................................ZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZ......56
4.3.3.2 Derivaösierung.......................................................ZZZZZZZZZZZ...............56
4.3.3.3 Extraktion der Derivate mit Diethytether .... 57
4.3.3.4 HPLC-AnaJyse............................................ZZZZZZZZZZZZZZZZZ........®
4.3.3.5 Quantitative Auswertung......................................ZZZZZZZZZZZZ. .............58
4.3.4 Erfassung der Quaiitatskriterien der Methode ...58
4.3.4.1 Spezifflat............................................. ............................................ ... 59
4.3.4.2 Unearität der KaHbriergeraden...............................ZZZZZZZZ.............59
4.3.4.3 Untere Nachwetsgrenze...........................................ZZZZZZZZZ................6°
III
4.3.4.4 Genauigkeit................................................................................................60
4.4 Enzymatische Bestimmung von Harnstoff im Blutplasma.............................60
4.4.1 Durchführung....................................................................................................60
4.4.2 Chemikalien......................................................................................................61
4.4.3 Qualitätskriterien der Methode.........................................................................61
4.4.3.1 Spezifität.....................................................................................................61
4.4.3.2 Linearität der Kalibriergeraden...................................................................61
4.4.3.3 Untere Nachweisgrenze.............................................................................62
4.4.3.4 Reproduzierbarkeit.....................................................................................62
4.4.3.5 Gefriertaustabilität......................................................................................62
4.5 Hormonanalytik im Blutplasma.........................................................................62
4.5.1 Cortisol.............................................................................................................62
4.5.2 Testosteron......................................................................................................63
4.6 Bestimmung der DNA-, RNA- und Proteingehalte in Gewebeproben............63
4.6.1 Vorversuche zur Isolierung der Nucleinsäuren.................................................63
4.6.1.1 DNA-Isolierung in Anlehnung an Tiemeyer et al (1981).............................63
4.6.1.2 RNA-Isolierung durch saure Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-
Extraktion....................................................................................................64
4.6.1.3 Isolierung der Nucleinsäuren mittels Anionenaustauschersäulen..............66
4.6.2 Angewandte Methode zur Aufarbeitung von Gewebeproben: Schmidt-
Thannhauser-Aufarbeitung in der Modifikation von Munro Fleck..................67
4.6.2.1 Chemikalien................................................................................................67
4.6.2.2 Modifikationen zur Erhöhung der Praktikabilität und zur Minimierung von
Aufarbeitungsverlusten...............................................................................67
4.6.2.3 Durchführung..............................................................................................67
4.6.3 Angewandte Verfahren zur DNA-Bestimmung.................................................68
4.6.3.1 DNA-Bestimmung mit Diphenylamin {Vorversuche)...................................68
4.6.3.2 DNA-Bestimmung mit dem Fluorochrom H 33258.....................................69
4.6.3.2.1 Chemikalien...........................................................................................69
4.6.3.2.2 Lösungen...............................................................................................69
4.6.3.2.3 Etablierung eines H 33258-Assays zur DNA-Bestimmung in der DNA-
Fraktion der modifizierten Schmidt-Thannhauser-Aufarbeitung.............69
4.6.3.2.4 Durchführung.........................................................................................70
4.6.3.2.5 Auswertung............................................................................................70
4.6.4 Angewandte Verfahren zur RNA-Bestimmung.................................................70
4.6.4.1 RNA-Bestimmung mit Orcinol {Vorversuche).............................................70
4.6.4.2 RNA-Bestimmung photometrisch...............................................................71
4.6.5 Proteinbestimmung..........................................................................................71
4.6.6 Ermittlung der Qualitätskriterien der Methode..................................................72
4.6.6.1 Eignung der Methode für die einzelnen porcinen Gewebe und Genauig-
keit..............................................................................................................72
4.6.6.1.1 Tritiierter DNA-Standard.........................................................................73
4.6.6.1.2 Durchführung der Aufarbeitung mit tritiierter DNA..................................73
4.6.6.1.3 Messung am ß-Zähler............................................................................73
4.6.6.2 Reproduzierbarkeit.....................................................................................74
4.6.6.3 Stabilität der Gewebe bei der Probenahme.............................................74
4.6.6.4 Spezifität der DNA- und RNA-Bestimmung.................!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!. 75
4.6.6.4.1 DNA-Bestimmung.......................................................!..!!!!!!!!!!!!!!!!!!!75
4.6.6.4.2 RNA-Bestimmung...........................................!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 75
4.7 Statistische Auswertung....................................................................................76
ERGEBNISSE.............................................................................................................77
5.1 Analytische Methoden............................................................... .......77
5.1.1 Bestimmung von Allantoin im Blutplasma....................... ...77
5.1.1.1 Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren !!!. . . !. . !!!!!!!!. 77
5.1.1.1.1 Photometrische Verfahren... ............. 77
5.1.1.1.2 Direkte HPLC-Verfahren....................!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!.....!!!!!!!!!!!!!! 77
5.1.1.1.3 HPLC-Verfahren mit Vorsäulenderivatisierung.!!!!!!!!!!!!!!!!............!.!.!!!.. 78
5.1.1.2 Angewandtes Verfahren....................................................!..!!!!. . !!!!!!!78
5.1.1.2.1 Prinzip des Verfahrens....................................... ........................ .79
5.1.1.2.2 Modifikationen im Vergleich zur Originalmethode........ .......80
5.1.1.2.3 Extraktion der Derivate mit Diethylether...............!!!!!!!!!!!! !! ! !!!!!!!!!!... 81
5.1.1.3 Qualitätskriterien der Allantoinbestimmung in porcinerri Blutplasma......!!.. 81
5.1.1.3.1 Spezifität.................................................... K 81
5.1.1.3.2 Linearität der Kalibriergeraden.....................!!!!.....................................!83
5.1.1.3.3 Untere Nachweisgrenze........................ü...............................................83
5.1.1.3.4 Genauigkeit (Richtigkeit, Reproduzierbarkeit)!!!!!!!!!!!!!!!!!.!!!!!!!!!!..!!!!!.!!!! 83
5.1.2 Bestimmung von Harnstoff im Blutplasma...................... ....84
5.1.2.1 Übersicht über in der Literatur beschriebene Verfahren.............................84
5.1.2.1.1 Diacetylmonoxim-Methode.................. ........................ 84
5.1.2.1.2 Urease-Berthelot-Methode.........!!!!!!!.!.!!!.!.............................................84
5.1.2.1.3 Urease-Glutamatdehydrogenase-MeÜiode!!!.........................................85
5.1.2.2 Angewandtes Verfahren........................................ .................. 85
5.1.2.3 Qualitätskriterien der Hamstoffbestimmung in porcinemiaütpiasma !!!!!! 85
5.1.2.3.1 Spezifität............................................ 85
5.1.2.3.2 Linearität der Kalibriergeraden.!!!!!!.!!!!!!!...!!!!!!!!!!.. ...........................ÜÜ85
5.1.2.3.3 Untere Nachweisgrenze........................... ..........................................87
5.1.2.3.4 Reproduzierbarkeit................. ....................................................88
5.1.2.3.5 Gefriertaustabiirtät.................... !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!....................!!.!!! 88
5.1.3 Bestimmung der DNA-, RNA- und Proteingehafte in Gewebeproben 88
5.1.3.1 Isolierung der Nucleinsäuren aus biologischem Material.... .....89
51311 Literaturübersicht über Verfahren zur Isolierung der Nucleinsäuren aus
biologischem Material................................ 89
5.1.3.1.2 Vorversuche zur Isolierung der Nucleinsäuren!!!!!!!!!!!!!.!.................!!!!!!! 90
5.1.3.1.3 Angewandte Methode zur Aufarbeitung von Gewebeproben- Schmidt-
Thannhauser-Aufarbeitung in der Modifikation von Munro Fleck .... 94
5.1.3.2 Bestimmung der Nucleinsäuren....................... 97
5.1.3.2.1 Übersicht über in der Literatur beschriebt Verfahren.........................97
5.1.3.2.2 Etablierungeines H 3325 AssayszurDNA-Bestimmung in cter DNA-
FraktkH» der modifizierten Schmklt-Tnannhauser-Aufarbeitung . 99
5.1.3.2.3 Angewandte Verfahren zur DNA-Bestimmung...... 99
5.1.3.2.4 Angewandte Verfahren zur RNA-Bestimmung......................................100
5.1.3.3 Qualitätskriterien der angewandten Methode...........................................100
5.1.3.3.1 Eignung der Methode für die verschiedenen porcinen Gewebe und
Genauigkeit..........................................................................................100
5.1.3.3.2 Reproduzierbarkeit...............................................................................103
5.1.3.3.3 Stabilität der Gewebe bei der Probenahme.........................................104
5.1.3.3.4 Spezifität der DNA- und RNA-Bestimmung..........................................104
5.2 Ergebnisse der physiologischen Untersuchungen im Blutplasma..............106
5.2.1 24 h-Profile zur Ermittlung der Beziehung zwischen Allantoin- und Cortisol-
konzentrationen im Blut im diumalen Verlauf.................................................106
5.2.1.1 Verlauf der Cortisolkonzentrationen.........................................................106
5.2.1.2 Verlauf der Allantoinkonzentrationen........................................................111
5.2.1.3 Niveau der Cortisol-und Allantoinkonzentrationen...................................111
5.2.1.4 Beziehung zwischen dem Verlauf der Cortisol- und Allantoinkonzentra-
tionen........................................................................................................112
5.2.2 Einfluß von ACTH-Infusionen auf die Cortisol- und Allantoinkonzentrationen
bei Ebern der Deutschen Landrasse (DL)......................................................113
5.2.2.1 Verlauf der Cortisolkonzentrationen und Konsequenzen für den
Allantoinveriauf.........................................................................................114
5.2.2.2 Niveau der Cortisol-und Allantoinkonzentrationen...................................115
5.2.2.3 Beziehung zwischen dem Verlauf der Cortisol- und Allantoinkonzentra-
tionen........................................................................................................116
5.2.3 Einfluß einer Testosteroninfusion auf die Allantoin- und Hamstoffkonzentra-
tionen im Blutplasma von Kastraten...............................................................117
5.2.3.1 Verlauf der Testosteronkonzentration......................................................119
5.2.3.2 Einfluß der Testosteroninfusion auf den Verlauf der Allantoinkonzentra-
tion............................................................................................................119
5.2.3.3 Einfluß der Testosteroninfusion auf den Verlauf der Harnstoffkonzentra-
tion............................................................................................................119
5.2.3.4 Beziehung zwischen den Parametern......................................................120
5.2.4 Versuch Gewebetiere Teil 1: Nutritive Einflüsse auf die Allantoinkonzentra-
tion im Plasma und Vergleich mit der Cortisolkonzentration..........................120
5.2.4.1 Nutritive Einflüsse auf die Gewichtsentwicklung der Versuchstiere..........120
5.2.4.2 Verlauf der Cortisolkonzentration.............................................................121
5.2.4.3 Nutritive Einflüsse auf den Verlauf der Allantoinkonzentration.................123
5.3 Ergebnisse der physiologischen Untersuchungen in verschiedenen
Geweben beim Schwein: DNA-, RNA- und Proteingehalte...........................125
5.3.1 Einfluß des Gewebetyps auf die Nucleinsäuren- und Proteingehalte............125
5.3.1.1 Verlauf der Nucleinsäuren- und Proteingehalte entlang des Dünndarms. 127
5.3.2 Einfluß der Rasse auf die Nucleinsäuren- und Proteingehalte.......................129
5.3.3 Versuch Gewebetiere Teil 2: Nutritive Einflüsse............................................131
5.3.3.1 Nutritive Einflüsse auf die Gewichtsentwicklung der Tiere.......................131
5.3.3.2 Nutritive Einflüsse auf die GewichtsentwicWung des Dünndarms............132
5.3.3.3 Nutritive Einflüsse auf die Nucleinsäuren- und Proteingehalte.................132
5.3.3.3.1 Nutritive Einflüsse auf die Milz.............................................................134
5.3.3.3.2 Nutritive Einflüsse auf Leber und Niere................................................135
5.3.3.3.3 Nutritive Einflüsse auf das Darmgewebe.............................................138
5.3.4 Einfluß der Art der Probenahme auf die Bestimmung bestimmter Parameter
in Lunge und Milz...........................................................................................142
6 DISKUSSION............................................................................................................144
6.1 Diskussion der verwendeten Methoden.........................................................144
6.2 Diskussion physiologischer Untersuchungen...............................................147
6.2.1 Diskussion der Allantoinbestimmungen im Blutplasma..................................147
6.2.2 Diskussion der Nucleinsäurenbestimmungen in Geweben............................150
7 ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................159
8 LITERATURVERZEICHNIS......................................................................................164
9 ANHANG: MESSWERTE..........................................................................................188
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