Beladung von dendritischen Zellen mit Antigen durch rekombinante Polyomavirus-VP1-Kapsoide:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 3
2.1. Allgemeines 3
2.2. Dendritische Zellen und die Präsentation von Antigenen 3
2.3. Dendritische Zellen als Induktoren von Immunreaktionen 6
2.4. Dendritische Zellen als Induktoren von Toleranz 6
2.5. Polyoma-VP1-Kapsoide als Transportvehikel zur Immunmodulation 7
2.5.1. Polyoma Pseudo-Kapside 7
2.5.2. Klassifizierung und Entdeckung des Polyomavirus 8
2.5.3. Humane Vertreter der Polyomaviren - das BK- und das JV-Virus 9
2.5.4. Aufnahme des Polyomavirus in die Zelle 10
2.5.5. Morphologie des Polyoma-Virus Kapsoids 12
2.5.6. Assemblierung von Polyoma-Virus Kapsoiden 14
2.5.7. Polyoma-VP1-Kapsoide als DNA-Transporter 15
3. Problemstellung und Zielsetzung 16
3.1. Hypothese 16
3.2. Fragestellungen 17
4. Ergebnisse 17
4.1. Differenzierung von Monozyten zu dendritischen Zellen 17
4.2. Analyse der Assemblierung von Polyoma-VP1-Kapsoiden 19
4.3. Beladung von Polyoma-VP1-Kapsoiden 20
4.3.1. Beladung von Polyoma-VP1-Kapsoiden mit FITC-markiertem Albumin.... 20
4.3.2. Beladung von Polyoma-VP1-Kapsoiden mit EGFP 22
4.4. Aufnahme von Polyoma-Kapsoiden und Transfer von Proteinen in humane
Antigen präsentierende Zellen 23
4.4.1. Interaktion von fluoreszenzmarkierten Polyoma-Kapsoiden mit Monozyten
und dendritischen Zellen 23
4.4.2. Interaktion von Albumin beladenen Polyoma-Kapsoiden mit Monozyten und
dendritischen Zellen 26
4.4.3. Inhibierung der Interaktion zwischen Polyoma-Kapsoiden und Monozyten
durch Blockierung der Fcy-Rezeptoren 28
4.4.4. Interaktion von EGFP-beladenen Polyoma-Kapsoiden mit Monozyten,
Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und dendritischen Zellen... 30
4.4.5. Analyse des Transfers von EGFP-Protein durch Polyoma-Kapsoide in
Monozyten, dendritischen Zellen, Makrophagen und neutrophilen
Granulozylen mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop 39
4.4.6. Analyse der zeilvermittelten Immunantwort nach Immunisierung von
Mäusen mit VP1-Kapsoiden 43
5. Diskussion 45
5.1. Interaktion von VP1-Polyomavirus-Kapsoiden mit APC 45
5.1.1. Interaktion von VP1-Polyomavirus-Kapsoiden mit Monozyten 46
5.1.2. Interaktion von VP1-Polyomavirus Kapsoiden mit dendritischen Zellen.... 47
5.1.3. Interaktion von VP1-Polyomavirus Kapsoiden mit Makrophagen 48
5.1.4. Interaktion von VP1-Polyomavtrus Kapsoiden mit neutrophilen
Granulozyten 49
5.2. Initiation einer Immunantwort durch das VP1 -Hüllprotein 49
6. Material und Methoden 51
6.1. Materialien 51
6.1.1. Reagenzien 51
6.1.2. Verbrauchsmittel 52
6.1.3. Geräte 52
6.2. Methoden 53
6.2.1. Blutspender 53
6.2.2. Isolation und Fraktionierung von peripheren Zellen des Blutes (PBMC).... 53
6.2.3. CD14-Positive Selektion von humanen Monozyten 53
6.2.4. In vitro Generierung von dendritischen Zellen aus humanen Monozyten.. 53
6.2.5. Immunfluoreszenzmessung bei Monozyten und dendritischen Zellen 54
6.2.6. Präparation von Polyoma-VP1-Proteinen aus E.coli. 54
6.2.7. Assemblierung von Polyoma-VP1-Kapsoiden aus rekombinanten VP1-
Pentameren.... 55
6.2.8. Analyse von Polyoma-VP1-Kapsoiden mittels Photonen-Korrelations-
Spektrometer 55
6.2.9. Auftrennung von VP1-Kapsoiden und -Pentameren 56
6.2.10. Analyse von Pofyoma-VP1-Kapsoiden mittels Transmissionselektronen¬
mikroskopie 56
6.2.11. Aufreinigung von anti-VP1-Maus-Antikörpern der Klasse lgG1 57
6.2.12. Aufreinigung von anti-VP1-Maus-Antikörpern der Klasse IgA 57
6.2.13. Markierung von Poryoma-VP1-Kapsoiden mit Fluorescein-isothiocyanat.. 58
6.2.14. PrSparation von FITC-markiertem Albumin assoziierten VP1-Kapsoiden.. 58
6.2.15. Aufreinigung von EGFP-VP2-Anker aus E.coli 59
6.2.16. Preparation von EGFP assoziierten Polyoma-VP1-Kapsoiden 60
6.2.17. Zytofluorometer-Messungen der PV-VP1-lnteraktion 61
6.2.18. Analyse der Kapsoid-Zell-lnteraktion mit dem konfokalen Mikroskop 62
6.2.19. Inhibierung der Kapsoid Zell-lnteraktion durch Blockierung der
Oberfiachenrezeptoren Fey I, II und III (CD64, CD32, CD16) 62
6.2.20. Immunisierung von C57/BI6 Mausen mit Polyoma-VP1-Protein 63
6.2.21. Isolation von T-Zellen aus den Milzen von Mausen 63
6.2.22. Restimulation von T-Zellen 64
6.2.23. Enzymgekoppelter Immunospot (EliSpot) 64
7. Literaturverzeichnis 66
8. Lebenslauf 74
9. Eigene Publikationen 75
10. Anhang ....,...„.,....,. 77
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