Microarrays:
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| Language: | German |
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Elsevier, Spektrum Akad. Verl.
2004
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| Series: | Der Experimentator
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|---|---|
| adam_text | Durch die Microarray-Technologie lassen sich sehr viele Fragestellungen
der Genexpression und des Drug-Targetscreenings beantworten, die auf¬
grund des High-Throughput-Screening auf schnelle und kostengünstige
Weise durchgeführt werden können. Allerdings ist diese relativ neue
Technologie teilweise sehr kompliziert, sodass für eine Abschätzung der
einzusetzenden Applikationen ein umfassendes Fachwissen hilfreich
bzw. manchmal erforderlich ist.
Dieses Buch widmet sich dem Thema Microarray mit verständlichen Er¬
klärungen und einer übersichtlichen Darstellung der zur Zeit verfügba¬
ren Instrumente, Biochips und Software. Es werden die unterschiedlichen
Anforderungen für DNA- und Proteinchips sowie Spotter und Scanner in
einzelnen Kapiteln aufgeführt. Der Leser erhält detaillierte Informatio¬
nen hinsichtlich der Mindestausstattung, um ggf. ein eigenes Micro-
array-Labor einzurichten oder auszuweiten. Außerdem wird auf das
High-Throughput-Screening, die Patent-Recherche und die Anforderun¬
gen eines Reinraums eingegangen. Eine umfassende Literatur- und Fir¬
menliste ist beigefügt.
Inhaltsverzeichnis
Danksagung
Vorwort
Abkürzungen
1 Einleitung 1
1.1 Terminologie..................................... 2
1.2 Entwicklung der Microarrays............................. 3
2 Anwendungen 7
2.1 Wissenschaftliche Fragestellung........................... 7
2.2 Das pharmazeutische Ziel............................... 10
2.3 Die Anforderungen der biotechnologischen Firmen................. 12
3 Technologie 15
3.1 Protein-Microarrays.................................. 15
3.1.1 Gen-und Proteinexpression......................... 15
3.1.2 Proteinallerlei: vom Molekül zum Biochip.................. 24
3.1.3 Proteinchips ................................. 40
3.2 Nucleinsäure-Microarrays .............................. 54
3.2.1 Hybridisierungssonden............................ 55
3.2.2 Geringe RNA-Mengen, was nun?...................... 62
3.2.3 Herstellung von DNA-Microarrays...................... 70
3.3 Microarray-Detektion................................. 75
3.3.1 Licht und Strahlung ............................. 76
3.3.2 Leuchtende Fluorophore........................... 78
3.3.3 Energiereiches Laserlicht........................... 83
3.3.4 Funktionsweise der Microarray-Scanner................... 86
3.3.5 Funktionsweise der Microarray-Imager................... 90
3.3.6 Dynamic Range................................ 91
3.3.7 Pixel und Spots................................ 92
3.4 Microarray-Markierungssysteme........................... 94
3.4.1 Tyramide-Signal-Amplification....................... 94
3.4.2 Dendrimere.................................. 95
3.4.3
3.4.4 Chemilumineszenz.............................. 98
3.4.5 Radioaktivität................................. 99
3.4.6 Time-Resolve-Fluorescence......................... 99
4 Instrumentation und Software 105
4.1 Microarray-Spotter.................................. 106
4.1.1 Mechanisches
XIV ■ Inhaltsverzeichnis
A.X.2 Piezo-Dispenser-Technologie ........................112
4.1.3
4.2 Digitalisierung - Die Microarray-Scanner......................116
4.2.1 Der Microarray-Imager............................117
4.2.2 Der Microarray-Scanner...........................117
4.3 Microarray-Software und Dokumentation......................117
4.3.1 Dokumentation der Microarray-Experimente................118
4.3.2 Design des Experiments...........................120
4.3.3 Absicherung der Ergebnisse.........................121
4.3.4 Microarray-Software.............................123
4.3.5 Vergleich von Expressionsdaten.......................129
4.3.6 Weitergehende Analyse............................130
4.4 Zusätzliches
Applikation......................................136
4.4.1 Verbrauchsmaterial..............................136
4.4.2 Weitere hilfreiche Laborgeräte........................137
4.5 Reinraum-Technologie................................137
4.5.1 Reinheitsklassen...............................138
4.5.2 Reinraum-Systeme..............................139
Die
5.1 Isolierung und Vorbereitung der Nucleinsäuren...................143
5.1.1 Isolierung von
5.1.2 mRNA-Isolierang aus Eukaryoten......................144
5.1.3 mRNA-Isolierang aus Bakterien.......................144
5.1.4 Sondenherstellung mithilfe der cDNA-Synthese...............145
5.1.5 Hybridisierung auf dem DNA-Biochip ...................146
5.1.6 Prä-Amplifizierung mithilfe der T7-RNA-Polymerase............146
5.1.7 Konstraktion der Microarray-Proben.....................148
5.1.8 Quantifizierungen - Überprüfungen - Sicherheiten.............149
5.1.9 Hybridisieren der Proben...........................149
5.1.10 Poly-L-Lysin-Beschichtung.........................151
5.2 Proteinarray-Protokolle................................151
5.2.1 Proteinarray-Puffer..............................152
5.2.2 Nachweis mit Antikörpern..........................154
5.2.3 Proteinkinase-Array: Nachweis mit 33P...................155
Hochdurchsatz-Screening 157
6.1 Laborautomation...................................15g
6.1.1 Laborautomationssoftware..........................160
6.1.2 Probenaufbereitung.............................161
6.1.3 Analyse und Auswertung...........................163
6.2 Drug-Target-Screening................................164
6.3 Klinische Chemie und
Datenbank-Recherche und Patente 169
7.1 Datenbank-Recherche.................................169
Inhaltsverzeichnis ■
7.2 Patente.........................................170
7.2.1 Patent-Recherche...............................172
7.2.2 Patentrechtlich geschützte Technologien...................179
7.3 Marken und Warenzeichen..............................182
8 Zukunftsaussichten 185
8.1 Technische Entwicklungen..............................185
8.2 Anforderungsprofile..................................187
8.3 Der Schluss vom Schluss...............................189
9 Appendix 191
9.1 Allgemeine Puffer...................................191
9.1.1
9.1.2 Blocklösungen................................191
9.1.3 Hybridisierungslösungen...........................192
9.2 Formeln zur Berechnung der Annealing-Temperatur von Oligonucleotiden.....192
9.2.1 Formel für Oligonucleotide bis 15 Basen ..................192
9.2.2 Formel für Oligonucleotide von 20 bis 70 Basen ..............192
9.3 Mol-Angaben und Berechnungen...........................192
9.3.1 Definition des Mols..............................192
9.3.2 Definition der molaren Masse und Molarität.................192
9.3.3 pmol-Mengenangaben für Nucleinsäuren..................193
9.3.4 Definition der Einheit
9.3.5 pmol-Mengenangaben für Proteine und
9.4 Kalkulation der Microarray-Spot-Fläche.......................195
9.5 Kalkulation der Microarray-Spot-Dichte.......................195
9.5.1 Spot-Dichte bezogen auf Center-To-Center-Distanz.............195
9.5.2 Spot-Dichte bezogen auf Anzahl der absoluten Spots pro cm2 .......195
9.6 Kalkulation der Fluorophore-oder Target-Dichte..................196
Firmenverzeichnis 197
WEB-Links 201
Sachverzeichnis 203
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