Charakterisierung des Zusammenspiels viraler und zellulärer Gene während der malignen Progression CRPV-induzierter Hauttumoren:
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| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Tübingen
Im Selbstverl.
2004
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| adam_text | 1 EINLEITUNG 1
1.1 Humane Papillomviren 1
1.2 Molekularbiologie humaner Papillomviren 4
1.3 CRPV-Tiermodell 8
1.4 Molekularbiologie von CRPV 9
1.4.1 Virale Genexpression 9
1.4.2 Frühe Proteine E6, E7 und E2 10
1.5 Aufgabenstellung im Rahmen dieser Arbeit 11
2 MATERIAL 14
2.1 Tiere 14
2.2 Tumorbiopsien 14
2.3 CRPV-Virusstock 15
2.4 Eukaryonte Zellen 15
2.5 Bakterien 15
2.6 Nukleinsäuren 15
2.6.1 Synthetisch hergestellte Oligonukleotide 15
2.6.2 Plasmide 17
2.6.3 Rekombinante Plasmide 17
2.6.4 Sonstige Nukleinsäuren und Nukieotide 19
2.6.5 Größenmarker 19
2.7 Enzyme 19
2.7.1 Restriktionsendonukleasen 19
2.7.2 Sonstige Enzyme 19
2.8 Fertige Reagenziensysteme 20
2.9 Reagenzien 20
2.10 Medien 21
2.10.1 Medien für die Zellkultur 21
2.10.2 Medien für die Bakterienkultur 21
3 METHODEN 22
3.1 Bakterienkultur 22
3.1.1 Kulturen für Plasmidisolierung 22
3.1.2 Herstellung kompetenter Bakterien 22
3.1.3 Transformation von Bakterien 23
3.2 Zellkultur 23
3.2.1 Isolation und Kultivierung primärer Kaninchenkeratinozyten 23
3.2.2 Einfrieren von Zellen 24
3.2.3 Transfektion eukaryonter Zellen 24
3.3 DNA-Methoden 25
3.3.1 Standardmethoden 25
3.3.2 Präparative Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterien 26
3.3.3 Fragmentelution aus Agarosegelen 26
3.3.4 Polymerasekettenreaktion (PCR) 26
3.3.5 Klonierung von PCR-Produkten für die quantitative (RT-)PCR 26
3.3.6 Quantitative PCR 27
3.3.7 DNA-Sequenzierung 29
3.3.8 Extraktion extrachromosomaler DNA aus eukaryonten Zellen 29
i
3.3.9 Extraktion gesamtzellulärer DNA aus Gewebe 30
3.3.10 Durchgehende radioaktive Markierung von cDNA 30
3.3.11 DNA-Blot-Hybridisierungen nach Southern 30
3.4 RNA-Methoden 31
3.4.1 RNA-Isolation aus Gewebe oder Zellkultur 31
3.4.2 Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion (Ein-Schritt-RT-PCR)
31
3.4.3 Zwei-Schritt-RT-PCR 32
3.4.4 RNA-RNA in situ Hybridisierung 32
3.4.4.1 Vorbereitung der Gewebeschnitte 32
3.4.4.2 Herstellung radioaktiv markierter RNA-Hybridisierungssonden mittels
in vitro Transkription 33
3.4.4.3 Radioaktive RNA-RNA in situ Hybridisierung 35
3.5 Protein-Methoden 37
3.5.1 Degradationsassays 37
3.5.1.1 In vitro Translation 37
3.5.1.2 Degradationsassay 37
3.5.2 Luziferase-Expressionsanalyse 38
3.6 Laser Capture Microdissection 38
4 ERGEBNISSE 40
4.1 In vitro Degradation von Kaninchen-p53 durch CRPV-E6 4°
4.2 Differenzielle Expression zellulärer Gene 42
4.2.1 Verifizierung der differenziellen Genexpression in acht Papillom-
Karzinom-Paaren mittels quantitativer RT-PCR 42
4.2.2 Verifizierung der differenziellen Genexpression in den Tumorzellen
durch Laser-Capture Microdissection mit anschließender RNA-Isolation
und quantitativer RT-PCR 46
4.2.3 Verifizierung der differenziellen Genexpression in den Tumorzellen
durch RNA-RNA in situ Hybridisierung 47
4.3 Viruslast in CRPV-induzierten Tumoren 52
4.4 Differenzielle Expression von Proteinasen 53
4.4.1 Differenzielle Expression von MMP9-Transkripten in CRPV-induzierten
Papillomen und Karzinomen des Hauskaninchens 54
4.4.2 Vergleich der Transkripte für E2 und MMP9 in CRPV-induzierten
Tumoren des Hauskaninchens 55
4.4.3 Induktion der MMP9-Expression durch E2 im Gewebe 57
4.5 Welche Mechanismen führen zur Hochregulation der zellulären Gene während
der malignen Progression? 59
4.5.1.1 Etablierung immortalisierter Zelllinien des New Zealand White
Hauskaninchens 60
4.5.1.2 Überexpression einzelner viraler Gene in RK1- bzw. RK2-16E7/ras60
4.5.2 Einfluss einzelner viraler Gene auf die zelluläre Genexpression 61
4.5.3 Quantitativer Nachweis von ras-Transkripten in RK1- bzw. RK2-
16E7/ras 65
4.5.4 Stabile Expression der viralen Gene in RK1 -16E7/ras und RK2-
16E7/ras 66
4.5.4.1 Nachweis der Transkripte der stabil exprimierten viralen Gene 66
4.5.4.2 Expression funktioneller E2-Proteine von CRPV E2, CRPV E2-I73A
und CRPV E2-R37K 68
ii
4.6 Replikation von CRPV in primären Zielzellen 70
5 DISKUSSION 72
5.1 CRPV-induzierte Kaninchen als Modellsystem für HPV-induzierte
Karzinome 72
5.2 Erhöhte Expression zellulärer Gene während der malignen Progression
CRPV-induzierter Tumoren 73
5.3 Induktion des zellulären Gens MMP9 durch das virale E2-Protein 76
5.4 Fazit 77
6 ZUSAMMENFASSUNG 79
7 ABKÜRZUNGEN 81
8 LITERATURVERZEICHNIS 83
9 DANKSAGUNG 96
iii
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