Regulation der DegS-Kinase-Aktivität und Analyse der Transkription des DegS-DegU-Regulons:
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|---|---|
| adam_text | Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
1. Zusammenfassung 1
2. Einleitung 2
2.1. Zwei-Komponenten Signalübertragungssysteme 2
2.1.1. Die Interaktionen der Histdin-Kinase mit dem Antwort-Regulator 3
2.1.2. Die Klassifizierung der Histidin-Kinasen und Antwort-Regulatoren 5
2.1.3. Regulation der Adaption an sich verändernde Umweltbedingungen 7
2.2. Das Regulationsnetzwerk der Zwei-Komponenten Signalübertra¬
gungssysteme der transienten und stationären Wachstumsphase.... 12
2.3. Das DegS/DegU Zwei-Komponenten Regulationssystem 16
2.3.1. Der pleiotrope Antwortregulator DegU 17
2.3.2. Die Histidin-Kinase DegS 20
2.4. Ziele dieser Arbeit 20
3. Ergebnisse 21
3.1. Konstruktion eines Überexpressionssystems für E. coli 21
3.2. Reinigung von DegS und DegU 22
3.2.1. Klonierung der Vektoren zur Überproduktion von DegS und DegU 22
3.2.2. Überproduktion von DegS und DegU in E. coli M13 23
3.2.3. Aufreinigung durch Anionen-Austauschchromathographie 24
3.2.4. Gelfiltration 25
3.2.4.1. Analytische Größenfraktionierung von DegS und DegU 25
3.2.5. Elutionsverhalten von DegS in Gegenwart von ATP 27
3.3. Strukturanalyse von DegS 28
3.4. Immunologische Untersuchungen 29
3.5. Charakterisierung des DegS/DegU-Regulons 30
3.5.1. Konstruktion der Mutante B. subtilis MD300 (Hy) 30
3.5.2. Transkriptionsanalyse unter Anwendung der Makro-Array Technik 31
3.5.3. Qualitative Analyse der DegU abhängigen Transkription in B. subtilis 168,
8. subtilis QB4414 und 8. subtilis MD300 32
3.5.4. Quantitative Analyse der DegU abhängigen Transkription in 6. subtilis 168,
8. subtilis QB4414 und 8. subtilis MD300 33
3.5.4.1. DegU-P vermittelte positive Regulation der Transkription 35
3.5.4.2. Negative Regulation der Transkription durch DegU-P 37
3.5.5. Autoregulation der Transkription von degU 38
3.6. Transkriptionsanalyse des degS/degU-Operons mit Promotordeletion. 39
3.6.1. Konstruktion von degS Promotordeletionsmutanten 40
3.6.2. Präparation der RNA aus den Promotordeletionsmutanten 44
3.6.3. Northern Blot 44
4. Diskussion 47
4.1. Reinigung und Charakterisierung der Histidin-Kinase DegS und des
Antwort-Regulators DegU 47
4.2. Charakterisierung des DegS/DegU-Regulons 48
4.3. DegU-P abhängige Transkription von degU 52
4.4. DegU: Ein pleiotroper Antwort-Regulator 55
5. Material und Methoden 57
5.1. Materialien 57
5.2. Verwendete Bakterienstämme und Plasmide 62
5.3. Medien, Lösungen und Puffer 64
5.3.1. Allgemeine Puffer und Lösungen 64
5.3.2. Pufferund Lösungen für die DNA-Gelelektrophorese 65
5.3.3. Puffer und Lösungen für die Protein-Getelektrophorese 65
5.3.4. Größenstandards für die Gelelektrophorese 65
5.3.5. Größenstandard für die Gelchromatographie 66
Inhaltsverzeichnis II
5.3.6. Bakteriennährmedien und fakultative Zusätze 66
5.4. Methoden 67
5.4.1. Allgemeine Methoden 67
5.4.2. Anzucht von Bakterien 68
5.4.3. Transformation von B.subtilis 69
5.4.4. Dauerkulturen von 8. subtilis _ 70
5.4.5. Methoden zur Proteinaufreinigung und -Charakterisierung 70
5.4.5.1. Zellaufschluss durch Ultraschallbehandlung 70
5.4.5.2. Oberexpressionstest 70
5.4.5.3. Proteinaufreinigung aus Einschlusskörpern 71
5.4.5.4. Proteinaufreinigung im „Batch -Verfahren 71
5.4.5.5. Immobilisierte-Metallionen-Affinitätschromatographie(IMAC) 72
5.4.5.6. Anionenaustauschchrornatographie(AIC) 73
5.4.5.7. Präparative Gelfiltration 73
5.4.5.8. Ammoniumsulfatfällung von Proteinen 73
5.4.5.9. Konzentration einer Proteinlösung 74
5.4.6. Präparation von Zellextrakt aus ß. subtilis 74
5.4.7. Proteinkonzentrationsbestimmung 74
5.4.8. Phosphorylierung von DegS 75
5.4.9. Immunologische Methoden 75
5.4.9.1. Immunisierung von Kaninchen zur Herstellung von polyklonalem
Serum 75
5.4.9.2. Western Blot mit polyklonalem anti-DegS und anti-DegU Serum 76
5.4.10. ß-Galaktosidase Aktivitätstests 76
5.4.11. Methoden mit Nucleinsäuren 77
5.4.11.1. DNA modifizierende Enzyme 77
5.4.11.2. Polymerasekettenreaktion (PCR) 77
5.4.11.3. Präparation chromosomaler DNA aus B- subtilis 78
5.4.11.4. RNA Präparation aus ß. subtilis 78
5.4.11.5. Elektrophorese mit denaturierendem Agarosegel (2,2 M Formaldehyd) 79
5.4.11.6. Northern Blot 80
5.4.11.7. Präparation DIG markierter RNA-Sonden 80
5.4.11.8. Hybridisierung der membranfixierten RNA 80
5.4.11.9. Detektion DIG markierter RNA 81
5.4.11.10. Präparation der 5 radioaktiv markierten Oligonucleotide 81
5.4.11.11. Primer Extension 82
6. Literaturverzeichnis 83
7. Publikationen 88
8. Anhang 90
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