Untersuchungen zur Proliferationsinhibition humaner, koronarer, glatter Muskelzellen: Vergleich zweier Strategien zur Prävention humaner Restenosen
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
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| Veröffentlicht: |
Tübingen, Waldeckstr. 2
<<S.>> Engel
2003
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Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung. 1
1.1. Die Atherosklerose 1
1.1.1. Ballondilation undRestenose 2
1.1.2. Mögliche therapeutische Ansätze zur Prävention der Restenose 3
1.2. Der Eukaryontische Zellzyklus bei Säuger. 4
1.2.1. Der Gl/S-Phase Kontrollpunkt 5
1.2.2. Zellzyklusregulatoren 6
1.2.2.1. Die pRB-Familie 7
1.2.2.2. Die E2F-Familie 7
1.2.2.3. CyclinE 8
13. Ribozyme. 9
1.4. Die Familie der natriuretischen Peptide 10
1.4.1. Das C-Typ natriuretische Peptid: Struktur, Synthese und Degradation 11
1.4.2. Der CNP spezifische Natriuretische-Peptid-Rezeptor-B (NPR-B) 12
1.4.3. CNP-abhängige Signaltransduktion:
Regulierung des cGMP-Spiegels in der Zelle 13
1.5. Zielsetzung dieser Arbeit. 15
2. Material und Methoden „ 17
2.1. Material „ 17
2.1.1. Chemikalien 17
2.1.2. Medien und Lösungen 19
2.1.2.1. Zellkulturmedien 19
2.1.2.2. Medienzusätze für die Zellkultur 19
2.1.2.3. Lösungen für die Zellkultur 19
2.1.2.4. Lösungen für Proteingele 20
2.1.2.5. Lösungen für Western Blot 22
Inhalt
2.1.2.6. Lösungen für DNA-Gele 23
2.1.2.7. Lösungen für Durchflusszytometrische Analysen 23
2.1.3. Verwendete Zellen 24
2.1.4. Synthetische Oligonukleotide 24
2.1.4.1. RT-Primer, PCR-Primer und Primer für die in vitro Transkription 24
2.1.5. Synthetische Hammerhead Ribozyme 25
2.2. Methoden 26
2.2.1. Isolierung von glatten Muskelzellen aus der Ratte und dem Schwein. 26
2.2.2. Zeilkultivierungsbedingungen 26
2.2.3. Passagieren von adhärenten glatten Muskelzellen 27
2.2.4. Einfrieren von glatten Muskelzellen 27
2.2.5. Trypanblaufärbung von glatten Muskelzellen 27
2.2.6. Transfektion von arretierten hCASMCs 28
2.2.7. Zellaufschluss 28
2.2.8. Proteinbestimmung 28
2.2.9. Membranproteinextraktion 29
2.2.10. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese(SDS-PAGE) 29
2.2.11. Western Blotting 29
2.2.12. Ponceau S Färbung von Proteinen auf PVDF-Membranen 30
2.2.13. Arretierung und Reproliferation von hCASMCs 30
2.2.14. Bromdesoxyuridin-Markierung von hCASMCs 30
2.2.15. Zellernte 31
2.2.16. Durchflusszytometrische Analysen (FACS-Analysen) 31
2.2.16.1. Analyse der hCASMCs mittels DNA-Färbungen 31
2.2.16.2. Analyse der hCASMCs mittels Protein-Färbung 32
2.2.17. Immunfluoreszenz 33
2.2.18. Isolierung von Gesamt-RNA aus hCASMCs 33
2.2.19. DNA und RNA Bestimmung 34
2.2.20. In vitro Transkription 34
2.2.21. Aufreinigung von DNA-Fragmenten und RNA-Fragmenten 34
2.2.22. DNA-Polyacrylamid Gelelektrophorese 34
2.2.22.1. NichtdenaturierendesPolyacrylamidgel 34
2.2.23. Reverse Transkription und PCR (RT-PCR) 35
2.2.24. Kompetitive RT-PCR. 35
Inhalt
2.2.25. Quantitative RT-PCR mit DNA-bindendem Fluoreszenzfarbstoff. 36
3. Ergebnisse 38
3.1. Etablierung von Bedingungen zur Kultivierung von humanen koronaren
glatten Muskelzellen -38
3.1.1. Proliferationsverhalten bei unterschiedlichen Kulturmedien 38
3.1.2. Proliferationsverhalten bei unterschiedlichen Zellpassagen 39
3.1.3. Proliferationsverhalten bei unterschiedlichen Serumkonzentrationen 40
3.1.4. Bestimmung der optimalen Zelldichte 41
3.2. Untersuchungen zur Synchronisation von hCASMCs durch Serumentzug 43
3.2.1. Zuordnung der unterschiedlichen Zellpopulationen in Zellzyklusphasen
mit Hilfe des FACS 43
3.2.2. Ermittlung der geeigneten Serumkonzentration für die Zellarretierung 45
3.2.3. Erstellung eines geeigneten Arretierungszeitraums 47
3.2.4. Nachweis des Proliferationsstatus von hCASMCs 50
3.3. Untersuchungen zur Reproliferation von hCASMCs durch Serumgabe 53
3.3.1. Bestimmung der Proliferationskinetik nach Arretierung 53
3.3.2. Verteilung der unterschiedlichen Zellpopulationen im Zellzyklus
während der Arretierung und Reproliferation 54
3.3.3. Vergleichbarkeit der verwendeten Zellchargen von hCASMCs 56
3.4. Einfluss von spezifischen katal) tischen RNAs (Hammerhead Ribozymcn)
gegen CyclinE und E2F-1 auf die Proliferation von hCASMCs 57
3.4.1. Ermittlung des Proteinspiegels von CyclinE und E2F-1 während der
Reproliferationsphase 5g
3.4.2. Quantifizierung des mRNA-Spiegels von CyclinE und E2F-1 während
der Reproliferationsphase 62
3.4.3. Transfizierbarkeit von hCASMCs mit Hammerhead Ribozymen über das
kationische Liposom Cellfectin 53
3.4.4. Untersuchungen des Reproliferationsverhaltens von hCASMCs
unter Einfluss von RZ(CyE) und RZ(E2F-1) 65
Inhalt
3.4.5. Untersuchungen der CyclinE und E2F-1 Proteinmengen während der
Reproliferation unter Einfluss von Hammerhead Ribozymen 68
3.4.6. Quantitative Bestimmung der mRNA von CyclinE und E2F-1 während der
der Reproliferation unter Einfluss von RZ(CyE) und RZ(E2F-1) 71
3.5. Einfluss von CNP auf das Proliferationsverbalten glatter Muskelzellen 73
3.5.1. Ermittlung der Kulturreinheit und Charakterisierung der glatten
Muskelzellen 73
3.5.2. Ermittlung des NPR-B Rezeptorstatus 77
3.5.2.1. Ermittlung des NPR-B Rezeptorstatus auf Proteinebene 77
3.5.2.2. Ermittlung des NPR-B Rezeptorstatus durch quantitative Bestimmung
der NPR-B mRNA 79
3.5.3. Untersuchungen zur Wirksamkeit von CNP auf die Reproliferationsphase
vonhCASMCs 81
3.5.4. Untersuchungen zum Reproliferationsverhalten glatter Muskelzellen aus
der Aorta der Ratte in Abhängigkeit von CNP 86
3.5.5. Untersuchungen zum Reproliferationsverhalten koronarer glatter
Muskelzellen aus dem Schwein in Abhängigkeit von CNP 89
4. Diskussion 93
4.1. Charakterisierung der glatten Muskelzellen 93
4.2. Die Fluoreszenzdurchflußzytometrie (FACS) 95
4.3. Synchronisation und Verteilung der Zellzykluspopulationen beim Zellzyklus¬
arrest durch Serumentzug oder durch chemische Zellzyklusinhibitoren 95
4.4. Charakterisierung der Reproliferationsphase ~ 98
4.5. Einfluss von RZ(CyE) und RZ (E2F-1) auf das Proliferationsverhalten
humaner glatter Muskelzellen.» 1 °
4.6. Bewertung der Hammerhead Ribozym-Strategie 102
4.7. Einfluss des NPR-B Rezeptorstatus auf die CNP-abhängige
Signaltransduktion ~ **4
4.8. Einfluss von CNP auf das Proliferationsverhalten humaner glatter
MuskelzeUen. „ 105
Inhalt
4.9. Wirkung des CNP auf das Proliferationsverhalten und die Verteilung der
Zellpopulationen im Zellzyklus: Vergleich von Spezies und Gefäßtypen 106
4.10. Bewertung der CNP-Strategie 107
4.11. Vergleichende Beurteilung von CNP-Strategie und Hammerhead
Ribozym-Strategie 110
5. Zusammenfassung 113
6. Literatur. 114
7. Abkürzungen „ 128
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| title_sub | Vergleich zweier Strategien zur Prävention humaner Restenosen |
| topic | ARTERIELLE STENOSEN + ARTERIELLE VERSCHLUSSKRANKHEITEN (PATHOLOGIE) CELL CYCLE, MITOTIC CYCLE (CYTOLOGY) CELLULES VASCULAIRES DE MUSCLES LISSES COEUR/VAISSEAUX CORONAIRES (PATHOLOGIE) CORONARY ARTERIES (PATHOLOGY) CYCLE CELLULAIRE + CYCLE MITOTIQUE (CYTOLOGIE) GLATTE GEFAESSMUSKELZELLEN HERZKRANZGEFAESSE (PATHOLOGIE) SMOOTH VASCULAR MUSCLE CELLS STENOSED ARTERIES + OCCLUSIVE ARTERIAL DISEASES (PATHOLOGY) STENOSES ARTERIELLES + MALADIES OCCLUSIVES ARTERIELLES (PATHOLOGIE) ZELLZYKLUS, ZELLTEILUNGSZYKLUS (CYTOLOGIE) Prävention (DE-588)4076308-0 gnd Restenose (DE-588)4254140-2 gnd |
| topic_facet | ARTERIELLE STENOSEN + ARTERIELLE VERSCHLUSSKRANKHEITEN (PATHOLOGIE) CELL CYCLE, MITOTIC CYCLE (CYTOLOGY) CELLULES VASCULAIRES DE MUSCLES LISSES COEUR/VAISSEAUX CORONAIRES (PATHOLOGIE) CORONARY ARTERIES (PATHOLOGY) CYCLE CELLULAIRE + CYCLE MITOTIQUE (CYTOLOGIE) GLATTE GEFAESSMUSKELZELLEN HERZKRANZGEFAESSE (PATHOLOGIE) SMOOTH VASCULAR MUSCLE CELLS STENOSED ARTERIES + OCCLUSIVE ARTERIAL DISEASES (PATHOLOGY) STENOSES ARTERIELLES + MALADIES OCCLUSIVES ARTERIELLES (PATHOLOGIE) ZELLZYKLUS, ZELLTEILUNGSZYKLUS (CYTOLOGIE) Prävention Restenose Hochschulschrift |
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