Funktionelle Charakterisierung des Aktivatorproteins pUL26 des humanen Cytomegalovirus durch Analyse zellulärer Bindungspartner und Konstruktion rekombinanter Viren:
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
ZUSAMMENFASSUNG
1
B.
EINLEITUNG
2
C.
FRAGESTELLUNG
8
D.
MATERIAL
UND
METHODEN
9
1.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
9
1.1.
BAKTERIEN
9
1.2.
HEFEZELLEN
9
1.3.
GEWEBEKULTURZELLEN
9
1.4.
VIRUSSTAEMME
9
1.5.
SEREN
UND
ANTIKOERPER
9
1.5.1.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
9
1.5.2.
POLYKLONALE
ANTIKOERPER
10
1.5.3.
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
10
2.
NUKLEINSAEUREN
11
2.1.
OLIGONUKLEOTIDE
11
2.1.1.
SEQUENZIERPRIMER
11
2.1.2.
PRIMER
UND
SONDE
FUER
REAL-TIME
PCR
11
2.1.3.
PRIMER
FUER
PCR-KLONIERUNG
11
2.2.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
13
2.2.1.
VEKTOREN
UND
VEKTORSYSTEME
13
2.2.2.
ZUR
VERFUEGUNG
GESTELLTE
PLASMIDE
14
2.2.3.
NEU
KONSTRUIERTE
PLASMIDE
15
2.2.3.1.
HEFEVEKTOREN
15
2.2.3.2.
EUKARYOTE
EXPRESSIONSVEKTOREN
16
2.2.4.
REPORTERKONSTRUKTE
19
2.2.5.
REKOMBINATIONSVEKTOREN,
COSMIDE
UND
BACMIDE
20
2.3.
SONSTIGE
NUKLEINSAEUREN
22
3.
ENZYME,
FEINCHEMIKALIEN
UND
MEDIEN
22
3.1.
ENZYME
22
3.2.
FEINCHEMIKALIEN
22
3.3.
MEDIEN
23
3.3.1.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
23
3.3.2.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
HEFEZELLEN
23
3.3.3.
MEDIEN
FUER
GEWEBEKULTUREN
24
3.4.
STANDARDPUFFER
24
4.
STANDARDMETHODEN
UND
REAGENZSYSTEME
24
5.
ZELLKULTURVERFAHREN
25
5.1.
ZELLKULTUR
25
5.2.
TRANSFEKTION
UND
INFEKTION
25
6.
REPORTERSYSTEME
ZUR
UNTERSUCHUNG
TRANSKRIPTIONELLER
AKTIVITAET
26
6.1.
LUZIFERASEANALYSE
26
6.2.
SL-ANALYSE
27
7.
IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSEN
27
8.
ANALYSE
VON
PROTEINEN
UND
PROTEIN/PROTEIN-INTERAKTIONEN
28
8.1.
HEFE-INTERAKTIONSKLONIERUNG
28
8.1.1.
HEFE-TRANSFORMATION
28
8.1.2.
FILTERLIFT-TEST
28
8.1.3.
ONPG-TEST
29
8.2.
IN
VITRO-ANALYSE
VON
PROTEIN/PROTEIN-INTERAKTIONEN
29
8.2.1.
REINIGUNG
VON
GST-FUSIONSPROTEINEN
AUS
E.COLI
29
8.2.2.
GELELEKTROPHORESE
UND
FAERBUNG
30
8.2.3.
IN
V;TRO-TRANSLATION
30
8.2.4.
GST-AFFINITAETSPRAEZIPITATION
30
8.3.
CO-IMMUNPRAEZIPITATION
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
30
9.
HERSTELLUNG,
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
31
9.1.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
VIREN
MITTELS
BACMID-TECHNOLOGIE
(BAC)
31
9.1.1.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
VON
LINEAREN
DNA-FRAGMENTEN
31
9.1.2.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
UEBER
CO-INTEGRATBILDUNG
32
9.2.
KOLONIE-PCR
32
9.3.
PRAEPARATION
UND
RESTRIKTIONSENZYM-SPALTUNG
VON
BACMID-DNA
33
9.4.
SOUTHERN
BLOT-ANALYSEN
33
9.4.1.
RADIOAKTIVER
SOUTHERN
BLOT
33
9.4.2.
NICHT-RADIOAKTIVER
SOUTHERN
BLOT
34
9.5.
VIRUSTITRATION
34
9.6.
ANZUCHT
UND
ISOLIERUNG
VON
HCMV
34
9.1.
REAL-TIME
PCR
35
9.8.
PLAQUEASSAYS
35
10.
COMPUTERANALYSEN
36
E.
ERGEBNISSE
37
1.
EXPRESSIONSKINETIK
UND
LOKALISATION
VON
PUL26
39
1.1.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
VON
PUL26
IM
VERLAUF
DER
HCMV-INFEKTION
39
1.2.
ZELLULAERE
LOKALISATION
VON
PUL26
IN
INFIZIERTEN
UND
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
41
2.
ANALYSE
DER
AKTIVIERENDEN
EIGENSCHAFTEN
VON
PUL26
43
2.1.
BESTAETIGUNG
DER
TRANSKRIPTIONELLEN
AKTIVIERUNG
VON
PUL26
ALS
GAL
FUSIONSPROTEIN
43
2.2.
EINFLUSS
VON
PUL26
AUF
HOMOLOGE
PROMOTOREN
45
2.3.
EINFLUSS
VON
PUL26
AUF
VERKUERZUNGEN
DES
LE-ENHANCER/PROMOTORS
47
2.4.
PUL26
HAT
KEINEN
EINFLUSS
AUF
DEN
ICAML-PROMOTOR
UND
KOOPERIERT
NICHT
MIT
ANDEREN
TEGUMENTPROTEINEN
DES
HCMV
48
2.5.
DIE
27KDA-ISOFONN
VON
PUL26
VERMITTELT
DIE
TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVIERUNG
IN
HUMANEN
VORHAUTFIBROBLASTEN
50
3.
WECHSELWIRKUNGEN
VON
PUL26
MIT
ZELLULAEREN
FAKTOREN
51
3.1.
QUALITATIVE
UND
QUANTITATIVE
BESTAETIGUNG
DER
WECHSELWIRKUNG
VON
PUL26
UND
SEINEN
ZELLULAEREN
INTERAKTIONSPARTNEM
52
3.2.
BESCHREIBUNG
DER
INTERAKTIONSPARTNER
VON
PUL26
54
3.3.
ZELLULAERE
LOKALISATION
DER
INTERAKTIONSPARTNER
VON
PUL26
56
3.4.
ANALYSE
DER
WECHSELWIRKUNG
VON
PUL26
UND
SEINEN
INTERAKTOREN
IN
VITRO
58
3.5.
EINGRENZUNG
DER
INTERAKTIONSDOMAENE
VON
PUL26
MIT
SEINEN
INTERAKTIONSPARTNEM
IN
HEFEZELLEN
59
3.6.
ANALYSE
DER
WECHSELWIRKUNGEN
VON
PUL26
UND
SEINEN
INTERAKTOREN
IN
VIVO
61
3.6.1.
BESTAETIGUNG
DER
HEFE
UND
IN
VITRO
DATEN
MITTELS
CO-IMMUN
PRAEZIPITATION
61
3.6.2.
EINGRENZUNG
DER
INTERAKTIONSDOMAENE
VON
PUL26
IN
VIVO
63
3.6.3.
INTERAKTION
VON
PUL26
MIT
DEN
ENDOGENEN
PROTEINEN
P68-HELIKASE
UND
HAX
1
67
3.6.4.
INTERAKTION
VON
PUL26
MIT
P68-HELIKASE
IN
INFIZIERTEN
ZELLEN
68
3.7.
EINFLUSS
DER
P68-HELIKASE
AUF
DIE
PUL26-VERMITTELTE
TRANSAKTIVIERUNG
69
3.7.1.
EINFLUSS
DER
P68-HELIKASE
AUF
DIE
VON
PUL26
VERMITTELTE
TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVIERUNG
AUF
RNA-EBENE
69
3.7.2.
UEBEREXPRESSION
DER
P68-HELIKASE
IN
CO-TRANSFEKTIONSEXPERIMENTEN
71
4.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
HUMANEN
CYTOMEGALOVIREN
MIT
EINER
DELETION
DES
UL26-LESERAHMENS
BZW.
EINER
UL26-GFP-FUSION
73
4.1.
STRATEGIE
DER
KONSTRUKTION
REKOMBINANTER
CYTOMEGALOVIREN
73
4.1.1.
ERZEUGUNG
REKOMBINANTER
VIREN
UEBER
HOMOLOGE
REKOMBINATION
LINEARER
FRAGMENTE
73
4.1.2.
ERZEUGUNG
EINER
UL26-REVERTANTE
UEBER
CO-INTEGRATBILDUNG
76
4.2.
VERIFIZIERUNG
REKOMBINANTER
BACMIDE
DURCH
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
77
4.3.
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
BACMIDE
MITTELS
KOLONIE-PCR
UND
RESTRIKTIONSENZYM-SPALTUNG
79
4.4.
REKONSTITUTION
UND
TITRATION
REKOMBINANTER
CYTOMEGALOVIREN
81
4.5.
ANALYSE
DER
GENEXPRESSION
NACH
INFEKTION
MIT
REKOMBINANTEN
VIREN
82
4.6.
REPLIKATIONSKINETIKEN
DER
REKOMBINANTEN
VIREN
84
4.7.
KINETIK
DER
PROTEINEXPRESSION
DER
REKOMBINANTEN
VIREN
IM
VERLAUF
DER
HCMV-INFEKTION
85
4.8.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
PLAQUE-BILDUNG
DER
REKOMBINANTEN
VIREN
88
4.9.
UNTERSUCHUNG
DER
REKOMBINANTEN
VIREN
MITTELS
REAL-TIME
PCR
90
4.10.
ANALYSE
DER
STABILITAET
DES
UL26-DELETIONSVIRUS
92
4.11.
NACHWEIS
VON
TEGUMENTPROTEINEN
IN
GEREINIGTEN
VIRIONEN
DES
WILDTYP-VIRUS
UND
DER
UL26-DELETIONSMUTANTE
95
4.12.
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
DARSTELLUNG
VON
VIRALEN
PARTIKELN
DES
WILDTYP-VIRUS
UND
DER
UL26-DELETIONSMUTANTE
96
F.
DISKUSSION
99
G.
ABKUERZUNGEN
110
IL
LITERATURVERZEICHNIS
111 |
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