Röntgenkristallographische und NMR-spektroskopische Untersuchungen an den substratbindenden Domänen des Thermosoms, des Chaperonins aus Thermoplasma acidophilum:
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
V
1.
ZUSAMMENFASSUNG
1
2.
EINLEITUNG
3
2.1.
MOLEKULARE
CHAPERONE
3
2.2.
DIE
ROLLE
VON
HSP60
UND
HSP70-FAMILIEN
BEI
DER
PROTEINFALTUNG
IN
DER
ZELLE
3
2.3.
DIE
CHAPERONINE
5
2.4.
ZIELSETZUNG
9
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
10
3.1.
CHEMIKALIEN
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
10
3.2.
GENTECHNISCHE
METHODEN
11
3.2.1.
STAEMME,
IHRE
KULTIVIERUNG
UND
TRANSFORMATION
11
3.2.2.
KLONIERUNG
DER
EXPRESSIONSPLASMIDE
13
3.2.3.
DNA-ANALYTISCHE
METHODEN
15
3.3.
PROTEINBIOCHEMISCHE
METHODEN
16
3.3.1.
EXPRESSION
DER
APIKALEN
DOMAENEN
DES
THERMOSOMS
16
3.3.2.
PROTEINREINIGUNG
UND
PROBENPRAEPARATION
DER
APIKALEN
DOMAENEN
DES
THERMOSOMS
18
3.3.3.
PROTEINANALYTISCHE
METHODEN
20
3.4.
KRISTALLOGRAPHISCHE
METHODEN
27
3.4.1.
KRISTALLISATION
27
3.4.2.
DATENSAMMLUNG
27
3.4.3.
STRUKTURLOESUNG
28
3.4.4.
GRAPHISCHE
DARSTELLUNG
29
3.5.
KERNSPIN-RESONANZ-SPEKTROSKOPIE
(NMR-SPEKTROSKOPIE)
30
INHALTSVERZEICHNIS
4.
ERGEBNISSE
33
4.1.
KRISTALLISATION
DER
SS-APIKALEN
DOMAENE
DES
THERMOSOMS
(SSADT)
33
4.1.1.
OPTIMIERUNG
DER
EXPRESSIONS
UND
PROTEINREINIGUNGSSTRATEGIE
33
4.1.2.
ANALYSE
DES
OLIGOMERISIERUNGSZUSTANDES
MITTELS
ANALYTISCHER
GELFILTRATION
37
4.1.3.
OPTIMIERUNG
DER
KRISTALLISATIONSBEDINGUNGEN
UND
DATENSAMMLUNG
38
4.1.4.
STRUKTURAUFLOESUNG
DURCH
MOLEKULAREN
ERSATZ
(MOLECULAR
REPLACEMENT)_
40
4.1.5.
DER
EINFLUSS
VON
SCHWERMETALLVERBINDUNGEN
AUF
DIE
SSADT-KRISTALLE
41
4.1.6.
DIE
KRISTALLSTRUKTUR
DER
SS-APIKALEN
DOMAENE
DES
THERMOSOMS
42
4.1.7.
DER
EINFLUSS
DER
KRISTALLPACKUNG
44
4.1.8.
DIE
HYDROPHOBIZITAET
DER
SSADT
45
4.2.
ANALYSE
DER
APIKALEN
DOMAENEN
IN
LOESUNG
46
4.2.1.
PROBENPRAEPARATION
FUER
DIE
NMR-SPEKTROSKOPIE
46
4.2.2.
ANALYSE
DER
SS-APIKALEN
DOMAENE
48
4.2.3.
ANALYSE
DER
A-APIKALEN
DOMAENE
55
5.
DISKUSSION
63
5.
STRUKTURVERGLEICH
VON
SUBSTRATBINDENDEN
DOMAENEN
ARCHAEALER
UND
EUKARYOTISCHER
GRUPPE
II
CHAPERONINE
63
5.1.
KRISTALL
UND
NMR-STRUKTUREN
UNTERSCHEIDEN
SICH
HAEUFIG
IN
KLEINEN,
ABER
BEDEUTSAMEN
EIGENSCHAFTEN
63
5.2.
EINE
VERGLEICHENDE
KRISTALLSTRUKTUR-ANALYSE
DER
APIKALEN
DOMAENEN
DES
THERMOSOMS
ZEIGT
SEGMENTALE
PLASTIZITAET
64
5.3.
NMR-SPEKTROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNGEN
AN
DEN
THERMOSOMALEN
SUBSTRAT
BINDUNGSDOMAENEN
BEWEISEN
DIE
HOHE
FLEXIBILITAET
DER
FORTSATZ-SEGMENTE
_
71
5.4.
BEWERTUNG
DER
VORLIEGENDEN
STRUKTURINFORMATIONEN
UND
MOEGLICHE
IMPLIKATIONEN
FUER
SUBSTRATINTERAKTIONEN
BEI
GRUPPE
II
CHAPERONINEN
72
5.5.
SCHLUSSBEMERKUNG
UND
AUSBLICK
90
6.
LITERATUR
94
7.
ABKUERZUNGEN
107
8.
ANHANG
110
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