Modulation und Auswirkung des Stickstoffmonoxid-Stoffwechsels in humaner Haut:
Gespeichert in:
1. Verfasser: | |
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Format: | Abschlussarbeit Buch |
Sprache: | German |
Veröffentlicht: |
2003
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Schlagworte: | |
Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
Beschreibung: | IX, 169 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm |
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245 | 1 | 0 | |a Modulation und Auswirkung des Stickstoffmonoxid-Stoffwechsels in humaner Haut |c vorgelegt von Alexandra Erlach |
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adam_text | MODULATION UND AUSWIRKUNG DES STICKSTOFFMONOXID- STOFFWECHSELS IN
HUMANER HAUT DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES EINES
DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN AUS DEM INSTITUT FUER BIOCHEMIE UND
LEBENSMITTELCHEMIE -ABTEILUNG FUER BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE- DES
FACHBEREICHS CHEMIE DER UNIVERSITAET HAMBURG VORGELEGT VON ALEXANDRA
ERLACH AUS SCHENEFELD HAMBURG 2003 ULB DARMSTADT 16733679
INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS I-VI
ABKUERZUNGEN VII-IX 1 EINLEITUNG 1 1.1 DIE HAUT 1 1.1.1 DIE HAUT ALS
ORGAN 1 1.1.2 MORPHOLOGIE DER HAUT 1 1.2 STICKSTOFFMONOXID 4 1.2.1
BIOSYNTHESE VON STICKSTOFFMONOXID 5 1.2.2 REGULATION DER NO-SYNTHESE 6
1.2.3 BIOLOGISCHE WIRKUNG VON NO 7 1.2.4 BEDEUTUNG VON STICKSTOFFMONOXID
IN DER MENSCHLICHEN HAUT 10 1.3 ZIEL DER ARBEIT 11 2 MATERIAL 13 2.1
STANDARD-LABORGERAETE 13 2.2 GERAETE UND MATERIAL FUER ZELLKULTURARBEITEN
15 2.3 GERAETE UND MATERIAL FUER HISTOLOGISCHE ARBEITEN 16 2.4 GERAETE UND
MATERIAL FUER GELELEKTROPHORETISCHE ARBEITEN 17 2.5 GERAETE UND MATERIAL
FUER IN VIVO- UND EX VIVO- TECHNIKEN 17 2.6 CHEMIKALIEN 18 3 METHODEN 22
3.1 SICHERHEIT UND ABFALLBESEITIGUNG 22 3.2 ZELLKULTUR 22 3.2.1
ZELLZAHLBESTIMMUNG 22 3.2.2 ISOLIERUNG EPIDERMALER UND DERMALER ZELLEN
AUS HAUTBIOPSIEN 22 3.2.3 KULTIVIERUNG UND SUBKULTIVIENING EPIDERMALER
UND DERMALER PRIMAERISOLATE .. 23 3.2.4 KULTIVIERUNG VON MAKROPHAGEN UND
LANGERHANS-AEQUIVALENTEN 24 3.2.4.1 ISOLIERUNG VON MONOZYTEN 24 3.2.4.2
KULTIVIERUNG VON MAKROPHAGEN 25 3.2.4.3 KULTIVIERUNG VON
LANGERHANS-AEQUIVALENTEN 26 INHALTSVERZEICHNIS 3.2.5 KULTIVIERUNG VON
ENDOTHELZELLEN, GLATTEN MUSKELZELLEN, NEONATALEN MELANOZYTEN UND
ZELLLINIEN 26 3.2.6 KRYOKONSERVIERUNG 26 3.2.7 WIEDERINKULTURNAHME DER
EINGEFRORENEN ZELLEN 27 3.2.8 KULTIVIERUNG VON SPHAEROIDEN 27 3.3
VORBEHANDLUNG DER ZELLEN IN VITRO 28 3.3.1 INKUBATION DER ZELLKULTUREN
MIT TESTSUBSTANZEN 28 3.3.2 STIMULATIONSVERSUCHE DER IN VFTRO-SYNTHESE
VON NO 29 3.3.3 UVA-BESTRAHLUNG IN VITRO 30 3.3.4 INKUBATION DER ZELLEN
IM HYPEROXISCHEN MILIEU 30 3.4 HISTOLOGISCHE ARBEITEN 30 3.4.1
OBJEKTTRAEGERBESCHICHTUNG 30 3.4.2 ANFERTIGUNG VON KRYOSTATSCHNITTEN 30
3.4.3 FIXIERUNG 31 3.4.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE NACHWEISMETHODEN 31 3.4.5
BILDANALYTISCHE DOKUMENTATION HISTOLOGISCHER PRAEPARATE 32 3.4.6
MIKROTITER-ASSAY FUER DEN HAEMOXYGENASE-1 -NACHWEIS 32 3.5 ERSTELLUNG VON
ZELLULAEREN EXTRAKTEN UND PROTEINBESTIMMUNG.33 3.5.1 GEWINNUNG VON
ZELLULAEREN EXTRAKTEN AUS KULTIVIERTEN ZELLEN 33 3.5.2 GEWINNUNG VON
ZELLULAEREN EXTRAKTEN AUS BIOPSIEMATERIAL UND SAUGBLASENEPIDERMIS 34
3.5.3 PROTEINBESTIMMUNG MIT DEM BCA-TEST. 34 3.6 WESTERN-BLOTTING 35
3.6.1 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 35 3.6.2 ELEKTRO-BLOT 36 3.6.3
IMMUNCHEMISCHE DETEKTION 37 3.7 QUANTIFIZIERUNG VON RADIKALISCHEM NO UND
DESSEN FOLGEPRODUKTEN NITRIT UND NITRAT 38 3.7.1
4,5-DIAMINOFLUORESCEIN-DIACETAT ZUR DIREKTEN MESSUNG VON
INTRAZELLULAEREM, RADIKALISCHEN NO ....38 3.7.2 ERMITTLUNG DES NITRIT-
BZW. NITRATGEHALTS MIT HILFE DES GRIESS- REAGENZES L 39 3.7.3 ERMITTLUNG
DES NITRITGEHALTS MIT 2,3-DIAMINONAPHTHALEN 39 3.8 FERRITIN-NACHWEIS AN
ZELLULAEREN EXTRAKTEN 40 3.8.1 FERRITIN-ELISA (ROECHE) 40 3.8.2 ERMITTLUNG
DES FERRITIN-GEHALTS MITTELS DER ELEKTROLUMINESZENZ- MESSUNG 42 3.9
BESTIMMUNG DES FREIEN INTRAZELLULAEREN EISENPOOLS 43 3.10 BESTIMMUNG DES
CGMP-GEHALTS 43 3.11 QUANTIFIZIERUNG DES PROSTAGLANDIN E-2 IM
KULTURUEBERSTAND....44 INHALTSVERZEICHNIS MI 3.12 QUANTIFIZIERUNG DER
MATRIXMETALLOPROTEINASE-1 IM KULTURUEBERSTAND 45 3.13 IN VITRO
UNTERSUCHUN G VERSCHIEDENER ALLGEMEINER PARAMETER DER ZELLPHYSIOLOGIE 45
3.13.1 BESTIMMUNG DER INTRAZELLULAEREN ESTERASEFUNKTION 45 3.13.2
BESTIMMUNG DES ZELLULAEREN GESAMTTHIOLSTATUS 46 3.13.3 BESTIMMUNG DES
MITOCHONDRIENMEMBRANPOTENTIALS.. 46 3.13.4 BESTIMMUNG DES
ZYTOPLASMATISCHEN PEROXIDSTATUS 47 3.13.5 BESTIMMUNG DES
LYSOSOMENINTEGRITAET 48 3.13.6 BESTIMMUNG DER RELATIVEN ZELLZAHL 48 I
3.14 IN VIVO- UND EX VIVO- STUDIEN 49 3.14.1 UNTERSUCHUNG DER
BEEINFLUSSUNG DER BENZOESAEUREREIZUNG 49 3.14.2 UNTERSUCHUNG DER
BEEINFLUSSUNG DER RASURREIZUNG 50 3.14.3 NO-MESSVERFAHREN IN VIVO 50
3.14.4 NITRIT- UND NITRATMESSUNG IN SAUGBLASEN-FLUESSIGKEIT. 51 3.15
STATISTISCHE AUSWERTUNG 52 4 ERGEBNISSE 53 4.1 UNTERSUCHUNGEN ZUM
GRUNDSTATUS DES NO-STOFFWECHSELS IN HUMANER HAUT 53 4.1.1 GRUNDSTATUS
DER INDUZIERBAREN NO-SYNTHASE 53 4.1.2 LOKALISATION DER LOESLICHEN
GUANYLATZYKLASE 54 4.1.3 NACHWEIS DER NO-INDUZIERBAREN CGMP-SYNTHESE 55
4.1.4 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION VON VASP IM WESTERN-BLOT 56 4.1.5
IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS VON S- NITROSOTHIOLEN UND NITROTYROSINEN
57 4.1.6 UNTERSUCHUNG DER NO-FREISETZUNG IM GRUNDZUSTAND 60 4.1.6.1
QUANTITATIVER NACHWEIS DER NO-SYNTHESE IN VITRO 60 4.1.6.2 DETEKTION DER
NO-FREISETZUNG UNGEREIZTER HAUT IN VIVO 62 4.2 BEEINFLUSSUNG DER
STICKSTOFFMONOXID-SYNTHESE 63 4.2.1 INDUKTION DER IN WTRO-SYNTHESE VON
NO 63 4.2.2 QUANTIFIZIERUNG DES NITRITGEHALTS IN SAUGBLASENFLUESSIGKEIT
NACH RASURREIZUNG 65 4.2.3 UNTERSUCHUNG DER DURCH EINE VORANGEGANGENE
RASUR INDUZIERTEN VERAENDERUNG DER NO-FREISETZUNG AUF DER HAUT 66 4.2.4
UNTERSUCHUNG DES NITRITGEHALTS VON SAUGBLASENFLUESSIGKEIT NACH
UV-BESTRAHLUNG 66 4.2.5 WIRKUNG VON L-ARGININ UND N-NITRO-L-ARGININ AUF
DIE UNMITTELBARE NO-EMISSION 67 4.3 MODULATION VERSCHIEDENER
ZELLPHYSIOLOGISCHER PARAMETER 68 4.3.1 BEEINFLUSSUNG DER VITALITAET 68
4.3.1.1 WIRKUNG DES NO-DONORS NOC 5 AUF DIE VITALITAET VON FIBROBLASTEN
UND ENDOTHELZELLEN 69 INHALTSVERZEICHNIS [ JV 4.3.1.2 EINFLUSS VON
HYPEROXIE AUF DIE VITALITAET IN FIBROBLASTEN 70 4.3.1.3 BETRACHTUNG DER
VITALITAETSAENDERUNG IN FIBROBLASTEN NACH UVA- BESTRAHLUNG UND NACH
ZUSAETZLICHER INKUBATION MITNOC 5 71 4.3.1.4 FOLGEN ERHOEHTER
EISENKONZENTRATIONEN FUER DIE VITALITAET IN FIBROBLASTEN 72 4.3.1.5
ESTERASEAKTIVITAET IN FIBROBLASTEN NACH INKUBATION MIT L-ARGININ. 72
4.3.1.6 UNTERSUCHUNG DER BEEINFLUSSUNG DER VITALITAET DURCH L-NAME....73
4.3.1.7 WIRKUNG VON NITROARGININ AUF DEN ESTERASEFUNKTIONS-STATUS DER
FIBROBLASTEN 74 4.3.1.8 BETRACHTUNG DER VITALITAET IN FIBROBLASTEN NACH
VORBEHANDLUNG MIT NATRIUMNITRIT... 74 4.3.2 GEHALT AN FREIEN THIOLEN....
75 4.3.2.1 DER ANTEIL AN FREIEN THIOLEN IN FIBROBLASTEN UND
ENDOTHELZELLEN NACH INKUBATION MIT NOC 5 76 4.3.2.2 EINFLUSS VON
HYPEROXIE AUF DEN ANTEIL AN FREIEN THIOLEN IN FIBROBLASTEN 77 4.3.2.3
EINFLUSS VON NO AUF DIE UV-BEDINGTE VERAENDERUNG DES THIOL- STATUS 78
4.3.2.4 VERAENDERUNG DES ANTEILS AN FREIEM THIOLEN DURCH EISEN 79 4.3.2.5
UNTERSUCHUNG DER WIRKUNG VON L-ARGININ AUF DEN ANTEIL AN FREIEN THIOLEN
IN FIBROBLASTEN 79 4.3.2.6 EINFLUSS VON L-NAME AUF DEN ANTEIL AN FREIEN
THIOLEN IN FIBROBLASTEN 80 4.3.2.7 VERAENDERUNG DES THIOL-STATUS DURCH
N-NITRO-L-ARGININ 81 4.3.2.8 WIRKUNG VON NATRIUMNITRIT AUF DEN GEHALT AN
FREIEN THIOLEN 81 4.3.3 UNTERSUCHUNG DES ZYTOPLASMATISCHEN
PEROXIDGEHALTS .....82 4.3.3.1 EINFLUSS VON NO-DONOREN AUF DEN GEHALT AN
LOESLICHEN PEROXIDEN 82 4.3.3.2 VERAENDERUNG DES PEROXID-STATUS DURCH
HYPEROXIE 83 4.3.3.3 WIRKUNG VON UVA BEI AN- UND ABWESEBHEIT VON NO AUF
DEN GEHALT AN REAKTIVEN SAUERSTOFFSPEZIES IN FIBROBLASTEN 84 4.3.3.4
UNTERSUCHUNGEN ZUM PEROXID-GEHALT BEI ERHOEHTEN EISENKONZENTRATIONEN 84
4.3.3.5 EINFLUSS VON L-NAME AUF DEN GEHALT AN LOESLICHEN PEROXIDEN IN
FIBROBLASTEN 85 4.3.3.6 VERAENDERUNG DES PEROXID-STATUS IN FIBROBLASTEN
DURCH N-NITRO-L-ARGININ . 86 4.3.3.7 WIRKUNG VON NATRIUMNITRIT AUF DEN
GEHALT AN LOESLICHEN PEROXIDEN 86 4.3.4 VERAENDERUNG DES
MITOCHONDRIENMEMBRANPOTENTIALS 87 4.3.4.1 EINFLUSS VON NO-DONOREN AUF
DAS MITOCHONDRIALE MEMBRANPOTENTIAL 88 4.3.4.2 WIRKUNG VON HYPEROXIE AUF
DAS MITOCHONDRIALE MEMBRANPOTENTIAL IN FIBROBLASTEN 89 4.3.4.3
UNTERSUCHUNG DES MITOCHONDRIENMEMBRANPOTENTIALS NACH UV- BESTRAHLUNG 90
4.3.4.4 VERAENDERUNG DES MITOCHONDRIENMEMBRANPOTENTIALS BEI ERHOEHTEN
EISENKONZENTRATIONEN ..91 4.3.4.5 EINFLUSS VON NITROARGININ, L-ARGININ
UND L-NAME AUF DAS MITOCHONDRIALE MEMBRANPOTENTIAL IN FIBROBLASTEN 92
INHALTSVERZEICHNIS V 4.3.4.5 WIRKUNG VON NATRIUMNITRIT AUF DAS
MITOCHONDRIALE MEMBRANPOTENTIAL 93 4.3.5 VERAENDERUNGEN DER
LYSOSOMENINTEGRITAET 94 4.4 MODULATION VON EISEN-STOFFWECHSELPARAMETERN
95 4.4.1 DIE HAEMOXYGENASE-1 -EXPRESSION ....95 4.4.1 .1 WIRKUNG VON NO
AUF DIE HO-1-EXPRESSION IN FIBROBLASTEN UND ENDOTHELZELLEN 95 4.4.1.2
EINFLUSS VON HYPEROXIE AUF DIE HO-1-EXPRESSION IN FIBROBLASTEN... . . 96
4.4.1.3 HO-1-EXPRESSION IN BESTRAHLTEN FIBROBLASTEN MIT UND OHNE NO-
DONOR INKUBATION 97 4.4.1.4 UNTERSUCHUNG DER HO-1-EXPRESSION BEI
ERHOEHTEN EISENKONZENTRATIONEN 98 4.4.1.5 EINFLUSS VON L-ARGININ,
N-NITRO-L-ARGININ, L-NAME UND NATRIUMNITRIT AUF DIE HO-1-EXPRESSION IN
FIBROBLASTEN 100 4.4.2 UNTERSUCHUNG DES FREIEN EISENPOOLS 100 4.4.2.1
FREIES EISEN IN NO-DONOR BEHANDELTEN FIBROBLASTEN UND ENDOTHELZELLEN 101
4.4.2.2 WIRKUNG VON HYPEROXIE AUF DEN FREIEN EISENPOOL IN FIBROBLASTEN
.: 101 4.4.2.3 VERAENDERUNG DES FREIEN EISENPOOLS NACH
UVA-BESTRAHLUNG.... 102 4.4.2.4 ANSTIEG DES INTRAZELLULAEREN FREIEN
EISENS IN FIBROBLASTEN NACH INKUBATION MIT EISENHALTIGEN VERBINDUNGEN
104 4.4.2.5 EINFLUSS VON L-ARGININ, L-NAME, N-NITRO-L-ARGININ,
NATRIUMNITRIT AUF DEN FREIEN EISENPOOL IN FIBROBLASTEN 105 4.4.3
UNTERSUCHUNG DES FERRITIN-STATUS 105 4.4.3.1 FERRITINGEHALT IN
FIBROBLASTEN NACH INKUBATION MIT NOC 5 105 4.4.3.2 VERAENDERUNG DES
FERRITINGEHALTS IN FIBROBLASTEN, DIE MIT UND OHNE NO-DONOR BESTRAHLT
WURDEN..... 106 4.5 MODULATION DER PGE-2-SYNTHESE 107 4.5.1 WIRKUNG VON
STICKSTOFFMONOXID AUF DIE PGE-2-SYNTHESE 107 4.5.2 EINFLUSS VON NOC 5
AUF DIE DURCH UVA ODER LPS INDUZIERTE PGE-2 SYNTHESE 107 4.6
UNTERSUCHUNG DER EXPRESSION DER MATRIXMETALLO- PROTEINASE-1 108 4.6.1
EXPRESSION DER MATRIXMETALLOPROTEINASE-1 IN NO-DONOR- INKUBIERTEN
FIBROBLASTEN 108 4.6.2 BEEINFLUSSUNG DER UVA INDUZIERTEN
EXPRESSIONSSTEIGERUNG DER MATRIXMETALLOPROTEINASE-1 DURCH
STICKSTOFFMONOXID 109 4.7 UNTERSUCHUNGEN ZUR GEFAESSANGIOGENESE 111 4.7.1
KOKULTUREN MIT ENDOTHELZELLEN 111 4.7.2 ETABLIERUNG DES TESTSYSTEMS:
SPHAEROIDE 111 4.7.3 EINFLUSS VON STICKSTOFFMONOXID UND HYPEROXIE AUF DIE
SPROSSUNG DER SPHAEROIDE 114 INHALTSVERZEICHNIS VI 4.8 WIRKUNG VON NO IN
VIVO 115 4.8.1 DIE NO-INDUZIERTE HAUTROETUNG 115 4.8.2 WIRKUNG ERHOEHTER
NO-KONZENTRATIONEN AUF DIE AUSPRAEGUNG DES BENZOESAEUREERYTHEMS 115 4.8.3
VERAENDERUNG DES RASURERYTHEMS DURCH N-NITRO-L-ARGININ UND NO :.118 5
DISKUSSION 120 5.1 NO-SYNTHESE UND -METABOLISMUS IN DER MENSCHLICHEN
HAUT 120 5.2 STIMULATION DER NO-SYNTHESE 123 5.3 WIRKUNG VON NO AUF
ALLGEMEINE ZELLPHYSIOLOGISCHE PARAMETER 126 5.3.1 VERAENDERUNG DER
ESTERASEAKTIVITAET 126 5.3.2 BEEINFLUSSUNG DES THIOLSTATUS 128 5.3.3
VERAENDERUNG DES GEHALTS AN LOESLICHEN PEROXIDEN 130 5.3.4 WIRKUNG
UNTERSCHIEDLICHER STRESSOREN AUF DAS MITOCHONDRIALE MEMBRANPOTENTIAL 132
5.3.5 LYSOSOMENINTEGRITAET BEI OXIDATIVEM STRESS 134 5.4 BEEINFLUSSUNG
DES EISENSTOFFWECHSELS 135 5.5 BEDEUTUNG VON NO BEI ENTZUENDLICHEN
REAKTIONEN UND WUNDHEILUNG 138 5.5.1 EINFLUSS VON NO AUF DIE
PGE2-SYNTHESE 138 5.5.2 WIRKUNG VON UVA UND NO AUF DIE MMP-1-EXPRESSION
140 5.6 UNTERSUCHUNG DER GEFAESSANGIOGENESE AN SPHAEROIDEN .....141 5.7 NO
UND HAUTROETUNG 142 5.8 FAZIT: WIE SINNVOLL IST DIE REDUKTION DER
NO-SYNTHESE BEI ENTZUENDLICHEN REAKTIONEN IN DER MENSCHLICHEN HAUT? 144 5
ZUSAMMENFASSUNG 145 6 SUMMARY 148 7 LITERATUR 150 ANHANG I CURRICULUM
VITAE II DANKSAGUNG
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