Differentielle Transkriptomanalyse bei Gangliosid-induzierter Reaktivierung des Epstein-Barr-Virus:
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| Published: |
2003
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-I-
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
2 MATERIAL UND METHODEN 6
2.1 CHEMIKALIEN 6
2.2 ZELLKULTUR 6
2.3 KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN 7
2.4 GANGLIOSIDE 7
2.5 STIMULIERUNG VON ZELLKULTUREN MIT DEM
GANGLIOSID IV
3NEUAC-NLCOSE4CER 8
2.6 ZELL PROLIFERATIONSTESTE 9
2.6.1 125IUDR-AUFNAHME-TEST 9
2.6.2 BRDU-AUFNAHME-TEST 9
2.7 ZYTOTOXIZITAETSTEST
10
2.8 NACHWEIS VON APOPTOSE 10
2.9 IMMUNFLUORESZENZ 11
2.9.1 VORBEREITUNG DER OBJEKTTRAEGER 11
2.9.2 IMMUNFLUORESZENZTEST 11
2.10 SUPERINFEKTION 12
2.11 ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN AUS ZELLKULTUREN 12
2.12 QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 13
2.13 DNASE I-SPALTUNG
13
2.14 CDNA-SYNTHESE 14
2.15 TRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN IM AGAROSEGEL 14
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/968799019
2.16 SEMIQUANTITATIVE RT-PCR 16
2.17 SEMIQUANTITATIVE
'LIMITED DILUTION'-PCR 17
2.18 DURCHFLUSSZYTOMETRIE 18
2.18.1 ZELLZYKLUSANALYSE 18
2.18.2 IMMUNPHAENOTYPISIERUNG 18
2.18.2.1 NACH GANGLIOSIDBEHANDLUNG 18
2.18.2.2 NACH SAH-TRANSFEKTION 19
2.19 DIFFERENTIELLE TRANSKRIPTOMANALYSE 19
2.19.1 DIFFERENTIAL DISPLAY REVERSE-TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-
KETTENREAKTION (DDRT-PCR) 19
2.19.2 TRENNUNG VON DNA IM HOCHAUFLOESENDEN POLYACRYLAMIDGEL 21
2.19.3 SILBERFAERBUNG VON POLYACRYLAMIDGELEN 22
2.19.4 ELUIERUNG VON DIFFERENTEN BANDEN 23
2.20
NOTHERN BLOT-ANALYSE 23
2.20.1 HERSTELLUNG DIGOXYGENIN (DIG)-MARKIERTER DNA-SONDEN 23
2.20.2 RNA-FORMALDEHYGELELEKTROPHORESE 24
2.20.3 NORTHERN TRANSFER 25
2.20.4 RNA-DNA-HYBRIDISIERUNG 26
2.20.5 IMMUNOLOGISCHER NACHWEIS DIGOXIGENIN-
MARKIERTER DNA-SONDEN 26
2.21
DNA-SEQUENZIERUNG 27
2.21.1 VORBEREITUNG VON PCR-PRODUKTEN 27
2.21.2 SEQUENZIERUNG 28
2.21.3 DNA-SEQUENZ-HOMOLOGIEVERGLEICH 29
-III-
2.22 UEBEREXPRESSION VON S-ADENOSYLHOMOCYSTEIN-HYDROLASE
(SAH) IN RAJI-ZELLEN 29
2.22.1 PRAEPARATION DES S-ADENOSYLHOMOCYSTEIN-HYDROLASE
(SAH)-GENS 29
2.22.2 KONSTRUKTION EINES SAH-EXPRESSIONSVEKTORS
FUER EUKARYONTISCHE ZELLEN 30
2.22.3 PLASMIDPRAEPARATION AUS BAKTERIENZELLEN 31
2.22.4 TRANSFEKTION EUKARYOTISCHER ZELLEN 31
2.23 IMMUNBLOT
32
2.23.1 PRAEPARATION VON ZELL-LYSATEN 32
2.23.2 SDS-POLYACRYAMIDGELELEKTROPHORESE 33
2.23.3 WESTERN BLOT 35
2.23.4 COOMASSIE-BLAU-FAERBUNG VON POLYACRYLAMID-GELEN 35
2.23.5 IMMUNFAERBUNG 35
3
ERGEBNISSE 37
3.1 DER EINFLUSS DES GANGLIOSIDS IV
3NEUAC-NLCOSE4CER AUF DIE
PHYSIOLOGIE VON HUMANEN BURKITT-LYMPHOMEN 37
3.1.1 ZELLWACHSTUM 37
3.1.2 NEKROSE 39
3.1.3 APOPTOSE 39
3.1.4 ZELLZYKLUS 39
3.1.5 IMMUNPHAENOTYPISIERUNG 41
3.2 DER EINFLUSS DES GANGLIOSIDS IV
3NEUAC-NLCOSE
4
CER
AUF DIE LATENZ DES EPSTEIN-BARR VIRUS 43
3.2.1 EXPRESSION LATENTER UND LYTISCHER VIRALER GENE 43
3.2.2 FREISETZUNG VIRALER DNA UND INFEKTIOESER VIRIONEN 45
-IV-
3.3 DIFFERENTIELLE TRANSKRIPTOMANALYSE NACH STIMULIERUNG VON
RAJI-ZELLEN MIT DEM GANGLIOSID IV
3NEUAC-NLCOSE4CER 47
3.4 UEBEREXPRESSION VON S-ADENOSYLHOMOCYSTEIN-HYDROLASE
(SAH) IN RAJI-ZELLEN 52
3.4.1 TRANSFEKTION VON VON RAJI-ZELLEN MIT DEM
EXPRESSIONSVEKTOR PCDNA-SAH 52
3.4.2 UEBEREXPRESSION VON SAH-TRANSKRIPTEN 52
3.4.3 UEBEREXPRESSION DES SAH-PROTEINS 53
3.5 INDUKTION DES LYTISCHEN ZYKLUS DES EPSTEIN-BARR VIRUS
DURCH SAH-UEBEREXPRESSION 54
3.5.1 EXPRESSIONSANALYSE LYTISCHER EBV-GENE DURCH RT-PCR 54
3.5.2 NACHWEIS DES EBV EARLY ANTIGENS (EA) DURCH
IMMUNFLUORESZENZ 55
3.5.3 BETEILIGUNG DER PROTEINKINASE C AN DER SAH-INDUZIERTEN
REAKTIVIERUNG DES LYTISCHEN EBV-ZYKLUS 57
3.6 ZELLPROLIFERATION UND EXPRESSION VON OBERFAECHENANTIGENEN IN
SAH-UEBEREXPRIMIERENDEN ZELLEN
58
3.6.1 BEEINFLUSSUNG DER ZELLPROLIFERATION DURCH
SAH-UEBEREXPRESSION 58
3.6.2 BEEINFLUSSUNG DER EXPRESSION VON OBERFAECHENMARKERN DURCH
SAH-UEBEREXPRESSION 59
4 DISKUSSION
61
5 ZUSAMMENFASSUNG 77
6 LITERATURVERZEICHNIS 79
7 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
94 |
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