Analyse der Phosphattranslokator-Genfamilie in Arabidopsis thaliana:
Saved in:
| Main Author: | |
|---|---|
| Format: | Book |
| Language: | German |
| Published: |
München
Verl. Dr. Hut
2003
|
| Edition: | 1. Aufl. |
| Series: | Biologie
|
| Subjects: | |
| Online Access: | Inhaltsverzeichnis |
| Item Description: | Zugl.: Köln, Univ., Diss., 2002 |
| Physical Description: | VI, 188 S. Ill., graph. Darst. : 21 cm, 265 gr. |
| ISBN: | 393476794X |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
PLASTIDEN
ALS
TYPISCH
PFLANZLICHE
ORGANELLEN
.
1
1.2.
TRANSPORTPROZESSE
UEBER
DIE
PLASTIDENHUELLE
.
2
1.3.
DIE
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATOREN.
2
1.4.
DIE
BEDEUTUNG
DER
SEQUENZIERUNG
DES
A.
THALIANA-GENOMS
.
5
1.5.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
8
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
9
2.1.
CHEMIKALIEN
.
9
2.2.
ENZYME
.
9
2.3.
BAKTERIEN
UND
HEFESTAEMME
.
9
2.3.1.
ESCHERICHIA
COLI
.
9
2.3.2.
AGROBACTERIUM.
TUMEFACIENS
.
10
2.3.3.
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
10
2.4.
VEKTOREN
.
10
2.5.
PHAGENBIBLIOTHEKEN
.
11
2.5.1.
ARABIDOPSIS
THALIANA
GENOMIC
LIBRARY
(FA.
CLONETECH).
11
2.5.2.
ARABIDOPSIS
THALIANA
5'-STRETCH
CDNA
LIBRARY
(FA.
CLONETECH)
.
11
2.6.
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
DNA
/
DNA-TECHNIKEN.
11
2.6.1.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
11
2.6.2.
ELUTION
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSE-GELEN
.
12
2.6.3.
FAELLUNG
VON
DNA
AUS
WAESSRIGEN
LOESUNGEN
.
13
2.6.4.
PHENOLEXTRAKTION
.
13
2.6.5.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
NUKLEINSAEUREN.
13
2.6.6.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
14
2.6.7.
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
KLONIERUNGSVEKTOREN
.
14
2.6.8.
PHOSPHORYLIERUNG
VON
DNA
.
14
2.6.9.
HERSTELLUNG
GLATTER
ENDEN
(FILL
IN)
.
15
2.6.10.
LIGATION
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
15
2.7.
ANZUCHT
UND
LAGERUNG
VON
ESCHERICHIA
COLI
UND
AGROBACTERIUM
TUMEFACIENS
.
16
2.8.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
.
17
2.8.1.
TRANSFORMATION
TSS-KOMPETENTER
ZELLEN
.
17
2.8.I.I.
HERSTELLUNG
TSS-KOMPETENTER
ZELLEN
(CHANG
&
MILLER,
1993)
.
17
INHALTSVERZEICHNIS
2.8.I.2.
TRANSFORMATION
VON
TSS-KOMPETENTEN
BAKTERIEN
.
18
2.8.2.
TRANSFORMATION
VON
AGROBAKTERIEN
.
18
2.8.2.I.
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
AGROBAKTERIEN
.
19
2.8.2.2.
TRANSFORMATION
ELEKTROKOMPETENTER
AGROBAKTERIEN
.
19
2.9.
COLONY-PCR
.
19
2.10.
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.COLI
NACH
BIMBOIM
&
DOLY
(1979)
.
20
2.10.1.
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
E.
COLI
-
ZELLEN
.
20
2.10.2.
PLASMIDISOLIERUNG
AUS
AGROBAKTERIEN.
21
2.11.
DURCHMUSTERUNG
VON
CDNA
UND
GENOMISCHEN
BANKEN
.
21
2.11.1.
AUSPLATTIERUNG
.
22
2.11.2.
AMPLIFIZIERUNG
VON
X
-PHAGEN
.
22
2.11.3.
PRAEPARATION
VON
X.
-PHAGEN
.
22
2.11.4.
DURCHMUSTERUNG
VON
CDNA
UND
GENOMISCHEN
BANKEN
.
23
2.12.
SOUTHERN
BLOT
(SOUTHERN,
1975)
.
.24
2.12.1.
ALKALISCHER
SOUTHERN
BLOT
.
24
2.12.2.
SOUTHERN
BLOT
FUER
GENOMISCHE
DNA
.
25
2.12.3.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
(LABELING)
.
25
2.13.
HYBRIDISIERUNG
VON
SOUTHERN
BLOTS
UND
PHAGEN-DNA
FILTERN
.
27
2.14.
ANZUCHT
UND
TRANSFORMATION
VON
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
28
2.14.1.
PFLANZENMATERIAL
.
28
2.14.2.
STERILISATION
DES
SAATGUTS
.
28
2.14.2.1.
FLUESSIG-STERILISATION.
28
2.14.2.2.
STERISILIERUNG
MIT
CHLORGAS:
.
28
2.14.3.
ANZUCHT
AUF
ERDE
.
28
2.14.4.
ANZUCHT
AUF
PLATTEN
.
30
2.14.5.
ANZUCHT
IN
STERILEN
SCHUETTELKULTUREN
.
31
2.14.6.
PFLANZEN-SELEKTIONEN
.
31
2.14.6.1.
SELEKTION
AUF
AGARPLATTEN.
31
2.14.6.2.
BASTA-SELEKTION.
32
2.15.
VAKUUMINFILTRATION
(NACH
BECHTHOLD
ET
AL.,
1993)
_
.
_
.
_
32
2.16.
PRAEPARATION
GENOMISCHER
DNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
33
2.16.1.
PRAEPARATION
NACH
AUSUBEL
ET
AL.,
1987
.
33
2.16.2.
DNA-SCHNELLPRAEPARATION
FUER
PCR-REAKTIONEN
.
35
2.16.3.
GENOMISCHE
DNA
AUS
A.
THALIANA
FUER
SOUTHERN
BLOT
ANALYSEN
.
36
2.17.
GUS-FAERBUNG
VON
A.
THALIANA-GEWEBE
.
37
2.18.
PARAFFINEINBETTUNG
UND
GEWEBESCHNITTE
VON
A.
THALIANA-MATERIAL
.
37
II
INHALTSVERZEICHNIS
2.18.1.
EINBETTUNG
.
37
2.18.2.
ANFERTIGUNG
VON
GEWEBESCHNITTEN
.
38
2.19.
PRAEPARATION
UND
ANALYSE
VON
RNA
.
39
2.19.1.
PRAEPARATION
VON
RNA
AUS
ARABIDOPSIS
THALIANA
(NACH
EGGERMONT
ET
AL.,
1996)
.39
2.19.2.
RNA-GELE
(NACH
AUSUBEL
ET
AL.,
1987)
.
39
2.19.3.
NORTHERN
BLOT
ANALYSE
.
40
2.19.4.
HYBRIDISIERUNG
EINES
NORTHERN
BLOTS
.
41
2.19.4.1.
HYBRIDISIERUNG
MIT
NORTHERN-HYBRIDISIERUNGSPUFFER
.
41
2.19.4.2.
CHURCH-PUFFER
(NACH
CHURCH
UND
GILBERT,
1984)
.
41
2.20.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR).
42
2.21.
SEQUENZIERUNGEN
.
43
2.22.
RT-PCR
.
44
2.22.1.
REVERSE
TRANSKRIPTION
.
44
2.22.2.
SEMIQUANTITATIVE
RT-PCR
.
45
2.22.3.
REAL
TIME
PCR
.
45
2.23.
PRAEPARATION
VON
SCHLIESSZELLEN
FUER
NACHFOLGENDE
RT-PCR
.
47
2.24.
PROTEINTECHNIKEN
.
47
2.24.1.
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
NACH
LAENUNLI
(1970)
.
47
2.24.2.
ANFAERBUNG
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
COOMASSIE
BRILLIANTBLAU
.
49
2.24.3.
PROTEINFAERBUNG
MIT
SILBEMITRAT
.
49
2.24.4.
ANFAERBEN
VON
PROTEINEN
IN
POLYACRYLAMIDGELEN
MIT
KUPFERCHLORID
.
50
2.24.5.
AUFARBEITUNG
VON
E.
COLI
GESAMTPROTEIN.
50
2.24.6.
ELEKTROTRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
PVDF-MEMBRANEN
(WESTEMBLOT)
.
51
2.24.7.
REINIGUNG
EXPRIMIERTER
FUSIONSPROTEINE
DURCH
AMYLOSE
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
51
2.24.7.1.
AMYLOSE-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
51
2.24.7.2.
REGENERATION
DES
SAEULENMATERIALS
.
52
2.25.
TRANSPORTEXPERIMENTE
.
53
2.25.1.
EXPRESSION
REKOMBINANTER
PHOSPHATTRANSLOKATOR-PROTEINE
IN
HEFE.
.
53
2.25.2.
HEFETRANSFORMATION
.
54
2.25.3.
EXPRESSION
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
.
54
2.25.4.
MECHANISCHER
AUFSCHLUSS
DER
HEFEZELLEN
.
55
2.25.5.
REINIGUNG
VON
HIS-GEKOPPELTEN
PROTEINEN
UEBER
NI-NTA
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
.
55
2.25.6.
REINIGUNG
DES
PHOSPHOLIPIDS
.
56
III
INHALTSVERZEICHNIS
2.25.7.
REKONSTITUTION
DER
MEMBRANPROTEINE
.
57
2.25.8.
MESSUNG
DER
TRANSPORTAKTIVITAET
.
58
2.25.8.1.
ABHAENGIGKEIT
DER
SUBSTRATAUFNAHME
IN
DIE
PROTEOLIPOSOMEN
VON
DER
REAKTIONSZEIT
(KINETIK):
.
58
2.25.8.2.
ABSTOPPEN
DES
TRANSPORTES
DURCH
EIN
INHIBITORENGEMISCH
.
58
2.25.9.
MESSUNG
DER
TRANSPORTAKTIVITAET
IN
PFLANZLICHEN
GEWEBEN
.
59
2.26.
STAERKEFAERBUNG
.
60
2.27.
BESTIMMUNG
VON
STAERKE/LOESLICHEN
ZUCKERN
.
60
2.28.
MIKROSKOPIE
UND
DOKUMENTATION
.
61
2.29.
INTEMETADRESSEN
.
62
3.
ERGEBNISSE.
63
3.1.
DIE
NST
(NUCLEOTIDE
SUGAR
TRANSPORTER)
-
TPT
(TRIOSEPHOSPHAT/PHOSPHATTRANSLOKATOR)
GENFAMILIE
IN
A.
THALIANA
.
63
3.1.1.
PLASTIDAERE
PHOSPHATTRANSOKATOREN
IN
A.
THALIANA
.
63
3.1.1.1.
DIE
VIER
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATOR-KLASSEN
.
63
3.1.1.2.
DIE
GENOMISCHE
STRUKTUR
DER
PHOSPHATTRANSLOKATORGENE
.
64
3.1.2.
PSEUDOGENE
DER
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATOREN
.
68
3.I.2.I.
GPT-PSEUDOGENE.
69
3.1.2.2.
PPT-PSEUDOGENE
.
71
3.I.2.3.
HERKUNFT
DER
PSEUDOGENE
.
74
3.1.3.
PT-HOMOLOGE
GENE
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
75
3.I.3.I.
PT-HOMOLOGE
SEQUENZEN
MIT
KONSERVIERTER
SUBSTRATBINDUNGSSTELLE
.
75
3.I.3.2.
WEITERE
PT-HOMOLOGE
SEQUENZEN
.
TI
3.1.4.
HYDROPHOBIZITAETSANALYSE
.
80
3.2.
EXPRESSIONSSTUDIEN.
82
3.2.1.
EXPRESSION
DER
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATORENEN
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA:
NORTHERN
BLOT
ANALYSEN
UND
RT-PCR
.
82
3.2.2.
WIRD
ATGPTL
IN
SCHLIESSEZELLEN
EXPRIMIERT?
.
91
3.2.3.
TAGESZEITLICHE
V
ARIATIONEN
DER
ATTPT-EXPRESSION
.
92
3.2.4.
EXPRESSION
PT-HOMOLOGER
GENE
.
93
3.2.5.
PROMOTOR
-
REPORTERGENFUSIONEN
DER
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATOREN.
94
3.2.5.I.
EXPRESSIONSMUSTER
DER
AFTPT-PROM::GUS
PFLANZEN
.
96
3.2.5.2.
EXPRESSION
DES
ATGPTL
-PROM::GUS
KONSTRUKTES
.
97
3.2.5.3.
LOKALISATION
DER
EXPRESSION
DES
ATPPTL
.
98
3.2.5.4.
EXPRESSION
DES
ATPPT2-PROM::GUS-KONSTRUKTES
.
102
IV
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
DER
PTS
.
103
3.3.1.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATOREN
IN
ESCHERICHIA
COLI
.
103
3.3.I.I.
KLONIERUNG
DER
PTS
IN
PMAL-C2
(NEB)
.
104
3.3.I.2.
GEWINNUNG
EINES
ATXPT-ANTIKOERPERS
.
105
3.3.I.3.
EXPRESSION
EINES
ATGPTL
-PCR-KONSTRUKTES
.
107
3.3.2.
HETEROLOGE
EXPRESSION
DER
ATGPTS
IN
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
109
33.2.1.
HERSTELLUNG
DER
ATGPT-P
YES/
NT2-KONSTRUKTE
UND
TRANSPORTMESSUNGEN
.
109
3.3.3.
MESSUNGEN
DER
GLKOEP-TRANSPORTAKTIVITAET
IN
BLAETTERN
UND
BLUETEN
.
111
3.3.4.
KOMPLEMENTIERUNG
EINER
PGI-MUTANTE
MIT
EW4,
ATGPTL
UND
ATGPT2
.
112
3.3.5.
MOEGLICHE
REGULATION
DES
GPTI
.
117
3.3.6.
KOMPLEMENTIERUNG
EINER
ATPPTL
-MUTANTE
MIT
ATPPTL
UND
ATPPT2
.
119
4.
DISKUSSION
.
121
4.1.
PLASTIDAERE
PHOSPHATTRANSLOKATOREN
IN
ARABIDOPSIS
THALIANA
.
----------
121
4.2.
EXPRESSIONSANALYSEN
MITTELS
RT-PCR
.
122
4.3.
SEQUENZANALYSE
DER
PLASTIDAEREN
PHOSPHATTRANSLOKATOREN
.
127
4.3.1.
DIE
EXON-INTRONSTRUKTUR
DER
PHOSPHATTRANSLOKATORGENE
.
127
4.3.2.
DIE
PT-PSEUDOGENE
.
132
4.4.
FUNKTIONEN
DER
PHOSPHATTRANSLOKATOREN
.
135
4.4.1.
DIE
FUNKTION
DES
GPT
IN
A.
THALIANA
.
135
4.4.I.I.
CHARAKTERISIERUNG
DES
ATGPTL
ALS
GLUKOSE
6-PHOSPHATTRANSPORTER.
135
4.4.1.2.
MOEGLICHKEITEN
DER
REGULATION
.
137
4.4.1.3.
WIRD
EIN
GPT
IM
MESOPHYLL
BENOETIGT?
.
140
4.4.I.4.
WIRD
EIN
GPT
IN
WURZELN
BENOETIGT?
.
141
4.4.1.5.
GPT-AKTIVITAET
IN
SCHLIESSZELLEN
.
142
4.4.I.6.
DIE
FUNKTION
DES
GPT
IN
BUENDELSCHEIDENZELLEN
.
142
4.4.2.
PHOSPHATTRANSLOKATOREN
IN
SICH
ENTWICKELNDEN
SAMEN
.
143
4.4.3.
MOEGLICHE
FUNKTIONEN
DER
ATPPTS
.
147
4.4.3.I.
FUNKTION
DES
PPT1
IN
DER
WURZEL
.
147
4.4.3.2.
FUNKTIONEN
DES
PPT1
IM
BLATT
UND
KOMPLEMENTATION
EINER
PPT1
MUTANTE.
.
147
4.4.3.3.
MOEGLICHE
FUNKTION
DES
PPT1
IN
DER
SIGNALTRANSDUKTION.
152
4.5.
PT-HOMOLOGE
SEQUENZEN:
NUKLEOTID-ZUCKERTRANSPORTER?
.153
4.6.
IDEEN
ZUM
URSPRUNG
DER
NST-TPT-GENFAMILIE.
158
V
INHALTSVERZEICHNIS
5.
ZUSAMMENFASSUNG.,.159
6.
ABKUERZUNGEN
.
161
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
163
8.
ANHAENGE
.
183
8.1.
DIE
KOMPARATIVE
CT-METHODE
(NACH
USER
BULLETIN#!,
APPLIED
BIOSYSTEMS,
1997)
.
183
8.2.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTIDE
.
185
VI |
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