Das Cysteine-String-Protein in Drosophila melanogaster: molekulare und funktionelle Analyse verschiedener CSP-Mutanten ; ein Modell zur räumlich und zeitlich kontrollierten CSP-Expression
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1.
EINLEITUNG
.
4
1.1.
DIE
SYNAPSE
.
5
1.2.
DER
SNARE-KOMPLEX
.
6
1.3.
DAS
CSP-PROTEIN
.
8
1.4.
EINZELNE
DOMAENEN
UND
INTERAKTIONSPARTNER
VON
CSP
.
13
1.4.1.
DIE
DNAJ-DOMAENE:
INTERAKTION
MIT
HITZESCHOCKPROTEINEN
.
14
DER
TRIMERE
CHAPERON-KOMPLEX
.
15
IN
VIVO
INTERAKTION
ZWISCHEN
DEM
HSC70-DROSOPHILA-HOMOLOG
HSC4
UND
CSP
.
17
EINE
MOEGLICHE
ROLLE
VON
CSP-CHAPERON-KOMPLEXEN
IN
NEURODEGENERATIVEN
PROZESSEN
.
18
1.4.2.
INTERAKTION
MIT
SYNTAXIN,
DER
SYNPRINT
SITE
DER
CA
2+
-KANAELE
UND
GSSY
.
19
VORGAENGE
IN
DER
PRAESYNAPSE
WAEHREND
EINES
AKTIONSPOTENTIALS
.
19
GSSY-UNTEREINHEITEN
REGULIEREN
N-P/Q-TYP
CA
2+
-KANAELE
VIA
DER
SYNPRINT
SITE
.
19
SYNTAXIN
INTERAGIERT
MIT
GSSY
UND
DER
SYNPRINT
SITE
.20
GSSY
INTERAGIERT
MIT
CSP
.
22
BESCHRIEBENE
INTERAKTIONEN
VON
CSP
UND
SYNTAXIN
.
23
1.4.3.
INTERAKTIONEN
MIT
DEM
POTENTIELLEN
CA
2+
-SENSOR
SYNAPTOTAGMIN
.
24
1.5.
AUFGABENSTELLUNG
.
27
2.
MATERIAL
.
28
2.1.
BAKTERIEN
UND
FLIEGENSTAEMME
.
28
2.2.
VEKTOREN
UND
MARKER
.
29
2.3.
OLIGONUKLEOTIDE
UND
RADIONUKLEOTIDE
.
30
2.4.
IMMUNGLOBULINE
.
30
2.5.
CHEMIKALIEN
UND
REAKTIONSKITS
.
30
2.6.
MEDIEN
UND
PUFFERLOESUNGEN
.
31
2.7.
ENZYME
.
33
2.8.
GERAETE
UND
HILFSMITTEL
.
33
3.
METHODEN
.
34
3.1.
ALLGEMEINE
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
34
3.1.1.
DNA-PRAEPARATIVE
METHODEN
.
34
3.1.2.
SINGLE
FLY
PCR
.
34
3.1.3.
LINKER-PCR
UND
DNA-SEQUENZIERUNG
.
34
3.1.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
.
35
3.1.5.
RNA-PRAEPARATIVE
METHODEN
.
35
3.1.6.
NORTHERN
BLOT
.
36
3.2.
MEMBRANFRAKTIONEN
.
36
3.3.
DICHTEGRADIENTENZENTRIFUGATION
.
37
3.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
38
3.4.1.
VERWENDUNG
VON
PROTEINA-AGAROSE
BEADS
DER
FIRMA
GIBCO
BRL
.
38
3.5.
WESTERN
BLOT
ANALYSE
.
39
3.6.
IMMUNHISTOCHEMIE
AN
KRYOSTATSCHNITTEN
VON
DROSOPHILA
MELANOGASTER
.
40
3.7.
KEIMBAHNTRANSFORMATION
.
40
4.
ERGEBNISSE
.
41
4.1.
BIOCHEMISCHE
UND
PHAENOTYPISCHE
ANALYSE
VERSCHIEDENER
CSP-MUTANTEN
.
41
4.1.1.
DAS
MUTIERTE
CSP-PROTEIN
.
41
4.1.2.
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
MUTANTEN:
WESTERN
BLOT
.
44
4.1.3.
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
MUTANTEN:
MEMBRANFRAKTIONEN
.
46
4.1.4.
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
MUTANTEN:
GLYCERINDICHTEGRADIENTEN
.
51
4.1.5.
BIOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
MUTANTEN:
IMMUNPRAEZIPITATION
.
56
4.1.6.
IMMUNHISTOCHEMISCHE
ANALYSE
DER
TRANSGENEN
MUTANTEN
.
61
4.1.7.
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
TRANSGENEN
MUTANTEN
.
63
4.2.
RAEUMLICH
UND
ZEITLICH
KONTROLLIERTER
VERLUST
DER
CSP-EXPRESSION
IN
DROSOPHILA
MELANOGASTER
.
66
4.2.1.
ERZEUGUNG
EINES
CSP-MOSAIKS
IN
DROSOPHILA
MELANOGASTER
MITHILFE
DES
FLIPPASE/FRT-SYSTEMS
AUS
DER
HEFE
SACCHAROMYCES
CEREVISIAE
.
66
4.2.2.
KLONIERUNG
DER
FRT-VEKTOREN
PS49-9
2XFRT
UND
PCACSP2XFRT
.
67
4.2.3.
FUNKTIONALITAET
DER
KONSTRUKTE
.
71
4.2.4.
SPEZIFISCHE
DELETION
DES
CSP-GENS
.
73
4.3.
DER
CSP-GENLOKUS
79
D3-4
.
78
4.3.1.
DIE
GENE
CG11523
UND
CG11489
.
80
4.3.2.
ANALYSE
DER
GENOMISCHEN
SITUATION
.
82
5.
DISKUSSION
.
85
5.1.
VERSCHIEDENE
CSP-MUTANTEN
.
85
5.1.1.
WELCHE
BEDEUTUNG
HAT
DIE
PALMITYLIERUNG
FUER
DAS
PROTEIN
CSP?
.
85
5.1.2.
INTERAKTIONEN
ZWISCHEN
CSP
UND
ANDEREN
SYNAPTISCHEN
PROTEINEN
.
90
5.2.
RAEUMLICH
UND
ZEITLICH
KONTROLLIERTER
VERLUST
DER
CSP-FUNKTION
IN
D.
MELANOGASTER
_
93
5.3.
DER
CSP-GENLOKUS
79
D3-4
.
96
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
99
7.
LITERATUR
.
104
8.
ANHANG
.
113
9.
ABKUERZUNGEN
.
122 |
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