Biologische Wirkungen der Aktivierung des Lymphotoxin-beta-Rezeptors:
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Regensburg
2003
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INHALTSVERZEICHNIS
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG. 1
1.1 LTSSR/LT-LIGANDEN-SYSTEM. 1
1.2 COLITIS ULCEROSA. 9
1.3 DIE MASTZELLE. 13
1.4 ZIEL DER ARBEIT. 17
2. MATERIAL. 18
2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN. 18
2.2 VERBRAUCHSMATERIAL UND GERAETE. 19
2.3 KITS. 20
2.4 MOLEKULARGEWICHTSSTANDARDS. 21
2.5 ANTIKOERPER UND ENZYME. 21
2.6 OLIGONUKLEOTIDE. 22
2.7 PUFFER UND LOESUNGEN. 23
2.8 ZELLLINIEN. 25
2.9 ZYTOKINE. 25
2.10 TIERE. 25
3. METHODEN. 26
3.1 ARBEITEN MIT RNA. 26
3.1.1 ISOLIERUNG VON TOTAL-RNA AUS ZELLEN. 26
3.1.2 ISOLIERUNG VON TOTAL-RNA AUS DARMGEWEBE. 26
3.1.3 REVERSE TRANSKRIPTION. 27
3.2 ARBEITEN MIT DNA. 27
3.2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR). 27
3.2.2 AGAROSE GELELEKTROPHORESE. 28
3.2.3 QUANTITATIVE RT-PCR MITTELS LIGHT CYCLER. 28
3.2.4 SOUTHERN BLOT. 29
3.3 PROTEINCHEMISCHE METHODEN. 30
3.3.1 DAS LTSSR:LG-FUSIONSPROTEIN. 30
3.3.2 REINIGUNG VON LTSSR:LG-FUSIONSPROTEIN AUS ZELLKULTURUEBERSTAND. 30
3.3.3 MESSUNG DER PROTEINKONZENTRATION. 30
3.3.4 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE. 31
3.3.5 COOMASSIE-FAERBUNG. 31
3.3.6 WESTERNBLOT. 32
3.3.7 BIOTINYLIERUNG VON ANTIKOERPERN. 32
3.3.8 FITC-MARKIERUNG VON PROTEINEN. 33
3.4 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN. 33
3.4.1 ZELLKULTURBEDINGUNGEN. 33
3.4.2 ZELLKULTURMEDIEN. 33
3.4.3 EINFRIEREN UND AUFTAUEN VON ZELLEN. 34
3.4.4 BESTIMMUNG DER LEBENDZELLZAHL. 34
3.4.5 MYCOPLASMENTEST. 34
3.4.6 EXPERIMENTE MIT PRIMAEREN VOM KNOCHENMARK STAMMENDEN POLYKLONALEN
MASTZELLEN (BONE MARROW-DERIVED MAST CELLS = BMMC). 34
3.4.6.1 GEWINNUNG UND KULTUR VON BMMC. 34
3.4.6.2 SELEKTION UND KULTUR VON MASTZELLEN. 35
3.4.6.3 ZYTOZENTRIFUGENPRAEPARATE. 35
3.4.6.4 MAY-GRUENWALD-GIEMSA-FAERBUNG. 35
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
_ ||
3.4.6.5 TOLUIDINBLAU-FAERBUNG. 35
3.4.6.6 INDUKTIONSEXPERIMENTE. 35
3.4.6.7 COKULTUREXPERIMENTE MIT AKTIVIERTEN T-ZELLEN UND BMMC. 36
3.4.6.8 SS-HEXOSAMINIDASE FREISETZUNG. 36
3.4.7 GEWINNUNG EINER ZELLSUSPENSION AUS MESENTERIALEN LYMPHKNOTEN. 37
3.4.8 DURCHFLUSSZYTOMETRIE. 37
3.4.8.1 ALLGEMEINE DURCHFLUSSZYTOMETRIE. 37
3.4.8.2 DUCHFLUSSZYTOMETRIE VON BMMC. 38
3.5 IMMUNOLOGISCHE METHODEN. 38
3.5.1 ALLGEMEINE ELISA-METHODE. 38
3.5.2 ELISA ZUR QUANTIFIZIERUNG VON MLTSSR:LG-TITERN IN SEREN. 38
3.5.3 ELISAS ZUR QUANTIFIZIERUNG VON IL-4, IL-6, MIP-2, TNF UND RANTES.
39
3.5.4 SERUMGEWINNUNG AUS MAUSBLUT. 39
3.6 IMMUNOHISTOCHEMISCHE VERFAHREN. 39
3.6.1 MADCAM-1-FAERBUNG VON MAUSEDICKDARM. 39
3.6.2 PNAD-FAERBUNG VON MAUSEDICKDARM. 40
3.6.3 FOLLIKULAER DENDRITISCHE ZELLEN (FDC)-FAERBUNG VON MAUSMILZ. 40
3.7 MAEUSE. 41
3.8 INDUKTION EINER EXPERIMENTELLEN AKUTEN UND CHRONISCHEN COLITIS
MIT DEXTRANSULFAT (DSS). 41
3.8.1 INDUKTION EINER EXPERIMENTELLEN AKUTEN COLITIS. 41
3.8.2 INDUKTION EINER EXPERIMENTELLEN CHRONISCHEN COLITIS. 42
3.9 BESTIMMUNG VON ENTZUENDUNGSPARAMETERN DES DICKDARMES. 42
3.9.1 HISTOLOGISCHER SCORE. 43
3.9.2 LYMPHFOLLIKEL-SCORE. 43
3.9.3 GEWICHTSVERAENDERUNG. 43
3.9.4 MYELOPEROXIDASE-AKTIVITAET. 44
3.9.5 DICKDARMLAENGE. 44
3.10 LN VIVO FLUORESZENZMIKROSKOPIE. 44
3.11 STATISTIK. 45
4. ERGEBNISSE. 46
4.1 REINIGUNG UND TEST DER BIOLOGISCHEN AKTIVITAET DES LTSSRRLG-
FUSIONSPROTEINS. 46
4.1.1 LTSSR:LG-FUSIONSPROTEIN. 46
4.1.2 REINIGUNG. 46
4.1.3 BINDUNGSFAEHIGKEIT AN AKTIVIERTE T-ZELLEN
IN VITRO
. 47
4.1.4 BIOLOGISCHE AKTIVITAET. 48
4.1.5 PHARMAKOKINETIK. 49
4.2 HEMMUNG DER LTSSR-AKTIVIERUNG IN GESUNDEN MAEUSEN. 50
4.2.1 EINFLUSS AUF ENTZUENDUNGSPARAMETER DES DICKDARMS. 50
4.2.1.1 HISTOLOGIE UND HISTOLOGISCHER SCORE. 50
4.2.1.2 LYMPHFOLLIKEL-SCORE. 52
4.2.1.3 GEWICHTSVERLUST. 52
4.2.1.4 MYELOPEROXIDASE-AKTIVITAET. 52
4.2.1.5 DICKDARMLAENGE. 53
4.2.2 LT XISS2/LIGHT-EXPRESSION VON MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 54
4.2.3 ZYTOKINEXPRESSION VON MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 55
4.3 HEMMUNG DER LTSSR-AKTIVIERUNG BEI MAEUSEN MIT AKUTER DSS-
INDUZIERTER COLITIS. 56
4.3.1 EINFLUSS AUF ENTZUENDUNGSPARAMETER DES DICKDARMS. 56
4.3.1.1 HISTOLOGIE UND HISTOLOGISCHER SCORE. 56
4.3.1.2 LYMPHFOLLIKEL-SCORE. 59
4.3.1.3 GEWICHTSVERLUST. 50
INHALTSVERZEICHNIS
4.3.1.4 MYELOPEROXIDASE-AKTIVITAET. 60
4.3.1.5 DICKDARMLAENGE. 61
4.3.2 LTSSR/LT-LIGANDEN-EXPRESSION IM DICKDARM. 62
4.3.3 LTA1SS2/LIGHT-EXPRESSION AUF MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 63
4.3.4 EXPRESSION VON PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN IM DICKDARMGEWEBE.
64
4.3.5 ZYTOKINSEKRETION VON MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 65
4.4 AKUTE DSS-INDUZIERTE COLITIS IN LTSSR-/- MAEUSEN. 66
4.4.1 EINFLUSS AUF ENTZUENDUNGSPARAMETER DES DICKDARMS. 66
4.4.1.1 HISTOLOGIE UND HISTOLOGISCHER SCORE. 66
4.4.1.2 LYMPHFOLLIKEL-SCORE. 68
4.4.1.3 GEWICHTSVERLUST. 69
4.4.1.4 DICKDARMLAENGE. 70
4.4.2 LTA^/LIGHT-EXPRESSION AUF MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 70
4.4.3 EXPRESSION VON PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN IM DICKDARMGEWEBE.
70
4.4.4 ZYTOKINSEKRETION VON MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 71
4.5 HEMMUNG DER LTSSR AKTIVIERUNG BEI MAESUEN MIT CHRONISCHER DSS- 72
INDUZIERTER COLITIS.
4.5.1 EINFLUSS AUF ENTZUENDUNGSPARAMETER DES DICKDARMS. 72
4.5.1.1 HISTOLOGIE UND HISTOLOGISCHER SCORE. 72
4.5.1.2 LYMPHFOLLIKEL-SCORE. 74
4.5.1.3 GEWICHTSVERLUST. 75
4.5.1.4 MYELOPEROXIDASE-AKTIVITAET. 75
4.5.1.5 DICKDARMLAENGE. 76
4.5.2 LTSSR/LT-LIGANDEN-EXPRESSION IM DICKDARM. 77
4.5.3 LTA, SS2/LIGHT-EXPRESSION AUF MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 78
4.5.4 EXPRESSION VON PROINFLAMMATORISCHEN ZYTOKINEN IM DICKDARMGEWEBE.
79
4.5.5 ZYTOKINSEKRETION VON MESENTERIALEN LYMPHOZYTEN. 80
4.5.6 EXPRESSION VON ADHAESIONSMOLEKUELEN NACH LTSSR:LG-BEHANDLUNG IM
DICKDARM VON MAEUSEN MIT CHRONISCHER DSS-INUDZIERTER COLITIS. 81
4.5.6.1 EXPRESSION VON MADCAM-1 IM DICKDARM NACH LTSSR:LG-BEHANDLUNG. 81
4.5.6.2 EXPRESSION VON PNAD IM DICKDARM NACH LTSSRRLG-BEHANDLUNG. 82
4.5.7 EXPRESSION DER LIGANDEN DER ADHAESIONSMOLEKUELE AUF MESENTERIALEN
LYMPHOZYTEN NACH LTSSRRLG-BEHANDLUNG. 82
4.5.8 YYROLLING", YYSTICKING" UND EXTRAVASATION VON LYMPHOZYTEN NACH
LTSSRRLG-
BEHANDLUNG. 83
4.5.8.1 YYROLLING" UND YYSTICKING"VON LYMPHOZYTEN IN SAMMELVENOLEN NACH
LTSSRRLG-BEHANDLUNG. 84
4.5.8.2 YYROLLING" UND YYSTICKING" VON LYMPHOZYTEN IN
POSTKAPILLARVENOLEN NACH
LTSSRRLG-BEHANDLUNG. 86
4.5.8.3 ANHAFTEN UND EXTRAVASIEREN VON LYMPHOZYTEN IN DER MUKOSA NACH
LTSSRRLG-BEHANDLUNG. 88
4.5.9 KOMBINATIONSBEHANDLUNG MIT LTSSRRLG UND ANTI-IFNY. 89
4.6 CHRONISCHE DSS-INDUZIERTE COLITIS IN LTSSR-/- MAEUSEN. 90
4.6.1 EINFLUSS AUF ENTZUENDUNGSPARAMETER DES DICKDARMS. 90
4.6.1.1 HISTOLOGIE UND HISTOLOGISCHER SCORE. 90
4.6.1.2 LYMPHFOLLIKEL-SCORE. 92
4.6.1.3 DICKDARMLAENGE. 93
4.6.2 MADCAM-1 -FAERBUNG IM DICKDARM. 93
4.7 EXPRESSION UND FUNKTIONALITAET DES LTSSR AUF BMMC. 95
4.7.1 MASTZELLSPEZIFITAET DER BMMC. 95
4.7.1.1 MAY-GRUENWALD-UND TOLUIDINBLAU-FAERBUNG. 95
4.7.1.2 FACS-ANALYSE DER BMMC AUF CD117-EXPRESSION. 95
4.7.2 NACHWEIS DER LTSSR-EXPRESSION AUF BMMC. 96
4.7.2.1 FACS-ANALYSE. 96
4.7.2.2 PCR-ANALYSE. 97
INHALTSVERZEICHNIS
IV
4.7.3 MLIGHT- UND 5G11B-STIMULIERUNG VON LONOMYCIN AKTIVIERTEN BMMC. 98
4.7.3.1 ZYTOKINFREISETZUNG. 98
4.7.3.2 DEGRANULATION.!. 101
4.7.4 COKULTIVIERUNGSEXPERIMENTE VON BMMC MIT AKTIVIERTEN T-ZELLEN. 102
4.7.4.1 ZYTOKINFREISETZUNG AUS BMMC. 102
4.7.4.2 DEGRANULATION VON BMMC. 105
4.7.4.3 ZYTOKINFREISETZUNG VON BMMC NACH BLOCKADE VON LTA^/LIGHT AUF
DER OBERFLAECHE VON AKTIVIERTEN T-ZELLEN. 106
5. DISKUSSION. 108
5.1 AUSWIRKUNGEN EINER LTSSR:L- BEHANDLUNG BEI GESUNDEN MAESUEN. 108
5.2 ROLLE DER LTSSR-AKTIVIERUNG IN DER DSS-INDUZIERTEN COLITIS. 108
5.2.1 ROLLE DER LTSSR-AKTIVIERUNG IN DER AKUTEN PHASE DER DSS-INDUZIERTEN
COLITIS. 108
5.2.2 ROLLE DER LTSSR-AKTIVIERUNG IN DER CHRONISCHEN PHASE DER
DSS-INDUZIERTEN
COLITIS. 113
5.3 EXPRESSION UND FUNKTIONALITAET DES LTSSR AUF BMMC. 118
6. ZUSAMMENFASSUNG. 122
6.1 ROLLE DES LTSSR IN DER AKUTEN DSS-INDUZIERTEN COLITIS. 122
6.2 ROLLE DES LTSSR IN DER CHRONISCHEN DSS-INDUZIERTEN COLITIS. 122
6.3 EXPRESSION UND FUNKTIONALITAET DES LTSSR AUF BMMC. 123
7. LITERATURVERZEICHNIS. 125
8. ABKUERZUNGEN. 139
9. DANKSAGUNG. 141
10. PUBLIKATIONEN. 142 |
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