Erweiterung des Substratverwertungsspektrums von Chemolithoautotrophen: Versuche zur Etablierung des 2,4-D-Abbaus in Paracoccus versutus
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2003
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INHALT
INHALTSVERZEICHNIS.I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.VI
ABBILDUNGSVERZEICHNIS.IX
TABELLENVERZEICHNIS.XII
1 EINLEITUNG.1
1.1 UMWELTBELASTUNGEN UND UMWELTRELEVANZ VON SCHADSTOFFEN.1
1.2 ENTWICKLUNG EINER THESE AM BEISPIEL AQUATISCHER HABITATE.3
1.2.1 PHYSIKO-CHEMISCHE EIGENSCHAFTEN AQUATISCHER HABITATE IN RELATION
ZU MIKROBIELLEM LEBEN
.3
1.2.1.1 KOHLENSTOFF-LIMITATION IM AQUIFER.3
1.2.1.2 SAUERSTOFF-LIMITATION IM AQUIFER.5
1.2.1.3 NIEDRIGTEMPERATUR-VERHAELTNISSE IM AQUIFER.6
1.2.2 ASPEKTE ZUM GENTRANSFER IN AQUATISCHEN HABITATEN.
1
1.2.3 FORMULIERUNG DER THESE UND SCHLUSSFOLGERUNGEN.9
1.3 AUSWAHL DES FAKULTATIV CHEMOLITHOAUTOTROPHEN BAKTERIUMS
PARACOCCUS VERSUTUS A2 ALS
MODELLORGANISMUS.
1.3.1 PHYSIOLOGISCHER HINTERGRUND VON
P. VERSUTUS A2.10
1.3.2 GENETISCHER HINTERGRUND VON
P. VERSUTUS A2.12
1.4 AUSWAHL DES DEGRADATIVEN PLASMIDES PJP4 FUER DEN GENTRANSFER -
GENETISCHE ORGANISATION
UND ROLLE BEIM ABBAU VON 2,4-DICHLORPHENOXYESSIGSAEURE (2,4-D).13
1.5 PRAEZISIERUNG DER ARBEITSAUFGABE. ^
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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II
2 MATERIAL UND METHODEN.16
2.1 BAKTERIENSTAEMME UND PLASMIDE.16
2.2 NAEHRMEDIEN.16
23
KULTIVIERUNG VON BAKTERIEN.19
2.3.1 WACHSTUM UNTER FCAFC/I-BEDINGUNGEN.19
2.3.1.1 KULTIVIERUNG FUER GENETISCHE UNTERSUCHUNGEN.19
2.3.1.2 KULTIVIERUNG FUER ABBAU-VERSUCHE.19
2.3.2 WACHSTUM UNTER
FEDBATCH- UND KONTINUIERLICHEN BEDINGUNGEN.20
2.3.3 STAMMHALTUNG.21
2.4 MESSUNG VON BAKTERIENWACHSTUM UND -VERMEHRUNG.21
2.4.1 TRUEBUNGSMESSUNG.21
2.4.2 BESTIMMUNG DER BIOMASSE.21
2.4.3 BESTIMMUNG KOLONIEBILDENDER EINHEITEN (KBE).22
2.5 ANTIBIOTIKA-UND SCHWERMETALL-RESISTENZUNTERSUCHUNGEN.22
2.6 UNTERSUCHUNG DER PLASMIDSTABILITAET.23
2.7 TRANSPOSON-MUTAGENESE.23
2.8 KONJUGATION.24
2.9 ISOLATION VON NUKLEINSAEUREN.25
2.9.1 PRAEPARATION GENOMISCHER DNA.25
2.9.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA.26
2.9.3 GEWINNUNG VON RNA.26
2.9.3.1 INDUKTION DER STAEMME.26
2.9.3.2 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA.26
2.9.3.3 QUALITAETSKONTROLLE DER RNA-PRAEPARATIONEN UND
DNASE-NACHBEHANDLUNG.27
2.10 ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG UND GROESSENBESTIMMUNG VON
NUKLEINSAEUREN.28
2.11 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN.29
2.12 FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN.29
2.13 RESTRIKTIONSANALYSEN.29
2.14
PCR
30
III
2.14.1 PRIMER UND REAKTIONSBEDINGUNGEN.30
2.14.2 REAKTIONSANSATZ.32
2.15 ELUTION UND REINIGUNG VON DNA-FRAGMENTEN UND PCR-PRODUKTEN AUS
AGAROSEGELEN 32
2.16 TRANSFER VON NUKLEINSAEUREN AUF NYLONMEMBRANEN.33
2.16.1 SOUTHERN-TRANSFER.33
2.16.2 NORTHERN-TRANSFER
(DOT BLOTTING).34
2.16.3
COLONY DOT BLOTTING.34
2.17 HYBRIDISIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.35
2.17.1 ERZEUGUNG DIGOXYGENIN-MARKIERTER DNA-SONDEN.35
2.17.2 HYBRIDISIERUNG.35
2.17.3 IMMUNOLOGISCHE DETEKTION.36
2.18 SEQUENZIERUNG VON DNA.36
2.18.1 PRIMER UND REAKTIONSBEDINGUNGEN.36
2.18.2 REAKTIONSANSATZ.37
2.18.3 AUSWERTUNG DER DATEN.37
2.19 ANALYTISCHE MESSUNGEN.38
2.19.1 QUANTITATIVE BESTIMMUNG CHLORIERTER VERBINDUNGEN.38
2.19.2 QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON WACHSTUMSSUBSTRATEN UND CF-IONEN.38
2.19.3 AUFNAHME VON UV-VIS-SPEKTREN.39
2.20 METHODEN ZUR ENZYMCHARAKTERISIERUNG.39
2.20.1 KULTIVIERUNG DER BAKTERIEN UND ZELLAUFSCHLUSS.39
2.20.2 PROTEINQUANTIFIZIERUNG.39
2.20.3 BESTIMMUNG VON ENZYMAKTIVITAETEN.40
2.20.3.1 ALPHA-KETOGLUTARAT ABHAENGIGE 2,4-D-DIOXYGENASE (TFDA).40
2.20.3.2 DICHLORCATECHOL-L,2-DIOXYGENASE (TFDC).41
2.20.4 POLAROGRAFISCHE MESSUNG VON TFD-ENZYMAKTIVITAETEN (TFDB+TFDC).41
2.20.5 INDIREKTER NACHWEIS VON SS-KETOADIPAT (ROTHERA-TEST). 42
2.21 CHEMIKALIEN UND GERAETE.43
3 ERGEBNISSE.44
3.1 ERZEUGUNG DES REKOMBINANTEN PLASMIDES PJP4: :TN5-MOB UND
CHARAKTERISIERUNG
PLASMIDTRAGENDER ZWISCHENWIRTE.44
3.1.1 GEWINNUNG VON
R. EUTROPHA JMP222 (PJP4::TN5-MOF ) ALS ZWISCHENWIRT.44
IV
3.1.2 NACHWEIS DES PLASMIDES PJP4::TN5-IO6 IN
R. EUTROPHA JMP222 KLONEN.45
3.1.3 LOKALISATION VON
LN5-MOB AUF DEM REKOMBINANTEN PLASMID PJP4 UND EINE DARAUS
ABGELEITETE EINTEILUNG DER
R. EUTROPHA JMP222 KLONE.45
3.1.4 WEITERGEHENDE UNTERSUCHUNGEN ZUM INSERTIONSORT VON
TN5-MOB IM R. EUTROPHA JMP222
KLON TK1-A.47
3.1.5 UEBERTRAGUNG DES PLASMIDES PJP4::TN5-WOI UND DESSEN NACHWEIS IM
ZWEITEN
ZWISCHENWIRT
E. COLI DH5A.49
3.1.6 EXPRESSION DES PJP4 VERMITTELTEN 2,4-D-ABBAUS IN
R. EUTROPHA JMP222 (PJP4::TN5-IO ).
.50
3.2 UEBERTRAGUNG DES PLASMIDES PJP4::TN5-/WOFT IN DEN ZIELORGANISMUS
P. VERSUTUS.52
33 CHARAKTERISIERUNG VON
P. VERSUTUS (PJP4::TN5-/NOA) KLONEN.52
3.3.1 UNTERSUCHUNGEN ZUM KONJUGATIV UEBERTRAGENEN PLASMID PJP4::TN5-MOF
IN P. VERSUTUS KLO
NEN.53
3.3.1.1 NACHWEIS DES REKOMBINANTEN PLASMIDES PJP4::TN5-IOB.53
3.3.1.2 NACHWEIS EINES GROESSENVERAENDERTEN PJP4::TN5-MO UND
NEUEINTEILUNG DER
P. VERSUTUS
KLONE IN TK(-) UND TK(+).54
3.3.2 CHARAKTERISIERUNG VON TK(-) KLONEN.54
3.3.2.1 EXISTENZ DER F/D-GENE.54
3.3.2.2 NACHWEIS UND CHARAKTERISIERUNG VON
REARRANGEMENTS DES PLASMIDES PJP4::TN5-//IO6.55
3.3.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR STABILITAET DES PLASMIDES PJP4::TN5-/NOL IN
P. VERSUTUS A2.59
3.4 EXPRESSION DES PJP4 VERMITTELTEN 2,4-D-ABBAUS IN
P. VERSUTUS (PJP4::TN5-MOD).60
3.4.1 ABBAU VON 2,4-DICHLORPHENOXYESSIGSAEURE (2,4-D).60
3.4.1.1 KINETISCHE STUDIEN IM BATC/I-VERFAHREN.60
3.4.1.2 VERSUCHE ZUR INITIIERUNG DER DEGRADATIVEN LEISTUNG.61
3.4.2 ABBAU VON 2,4-DICHLORPHENOL (DCP).62
3.4.2.1 KINETISCHE STUDIEN IM
BATCH-,FEDBATCH- UND KONTINUIERLICHEN VERFAHREN.62
3.4.2.2 FREISETZUNG VON 3,5-DICHLORCATECHOL (DCC) UND CHLORID-IONEN
(C1').67
3.4.2.3 VERFAERBUNG DER
P. VERSUTUS A2 (PJP4::TN5-/O() KULTUREN.70
3.4.3 STUDIEN ZUR TRANSKRIPTION VON
TFD-GENEN.71
3.4.4 BESTIMMUNG VON TFD-ENZYMAKTIVITAETEN UND AUSSAGEN ZU ANDEREN MIT
DEM 2,4-D-STOFF-
WECHSEL ASSOZIIERTEN ENZYMEN.73
3.4.4.1 INDIREKTER NACHWEIS FUER DIE EXISTENZ VON
SS-KETOADIPAT-COA-TRANSFERASE UND
SS-KETOADIPYL-COA-THIOLASE.74
3.4.4.2 ALPHA-KETOGLUTARAT ABHAENGIGE 2,4-D-DIOXYGENASE
(TFDA)-AKTIVITAET.75
3.4.4.3 SUMMARISCHE AKTIVITAETEN DER DICHLORPHENOL-HYDROXYLASE (TFDB) UND
DICHLORCATECHOL-
1,2-DIOXYGENASE (TFDC).75
V
3.4.4.4 DICHLORCATECHOL-L,2-DIOXYGENASE (TFDC)-AKTIVITAET.76
4 DISKUSSION.78
4.1 UEBERTRAGUNG DES DEGRADATIVEN PLASMIDES PJP4 UND DESSEN ETABLIERUNG
IM MODELLSTAMM
PARACOCCUS VERSUTUS
.78
4.2 EXPRESSION DES PJP4 VERMITTELTEN 2,4-D-ABBAUWEGES IM MODELLSTAMM
PARACOCCUS VERSUTUS
. 89
5 SCHLUSSFOLGERUNGEN.104
LITERATURVERZEICHNIS.107 |
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