Untersuchungen zur Rolle des Chemokins CCL20 und seines Rezeptors CCR6 im Entzündungsprozess:
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1.
EINLEITUNG
.
6
1.1.
DIE
ENTZUENDUNG
.
:
.
6
1.2.
DIE
INFILTRATION
VON
LEUKOZYTEN
IN
ENTZUENDETES
GEWEBE
.
7
1.2.1.
TRANSENDOTHELIALE
MIGRATION
.
8
1.2.2.
CHEMOKINE
UND
CHEMOKINREZEPTOREN
.
12
1.2.3.
CCL20
.
14
1.2.4.
DER
CHEMOKINREZEPTOR
CCR6
.
15
1.3.
DAS
MODELL
DER
LEISHMANIOSE
IN
DER
MAUS
.
17
1.4.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
.
19
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
20
2.1.
MATERIAL
.
20
2.1.1.
VERSUCHSTIERE
.
20
2.1.2.
KULTUR
EUKARYONTISCHER
ZELLEN
.
20
2.1.3.
KULTUR
VON
BAKTERIEN
.
22
2.1.4.
PARASITEN
.
22
2.1.5.
CHEMIKALIEN
.
23
2.1.6.
ENZYME
UND
REKOMBINANTE
PROTEINE
.
23
2.1.7.
ANTIKOERPER
.
23
2.1.8.
VEKTOREN
.
23
2.1.9.
OLIGONUKLEOTIDE
.
24
2.1.10.
KITS
.
24
2.1.11.
RADIOCHEMIKALIEN
.
24
2.1.12.
VERBRAUCHSMATERIAL
.
24
2.1.13.
GERAETE
UND
HILFSMITTEL
.
25
2.2.
METHODEN
.
26
2.2.1.
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
26
2.2.1.1.
METHODEN
ZUR
RNA
ANALYSE
.
26
2.2.1.2.
MODIFIKATION
BAKTERIELLER
DNA
UND
KLONIERUNG
.
29
2.2.1.3.
ISOLATION
VON
PLASMID
DNA
UND
DNA
AUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
30
2.2.1.4.
METHODEN
ZUR
ANALYSE
VON
DNA
.
32
2.2.2.
BAKTERIOLOGISCHE
METHODEN
.
36
2.2.2.1
.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
36
2.2.2.2.
TRANSFORMATION
VON
BAKTERIEN
MIT
PLASMID-DNA
.
37
2.2.2.3.
ANZUCHT
UND
INDUKTION
DER
BAKTERIEN
AUS
DER
P1
GENBIBLIOTHEK
.
37
2.2.3.
KULTUR
UND
MANIPULATION
DER
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
AUS
DER
MAUS
.
38
2.2.3.1.
KULTUR
UND
INAKTIVIERUNG
DER
EMBRYONALEN
FIBROBLASTEN
.
38
2.2.3.2.
KULTUR
VON
ES
ZELLEN
.
39
2.2.3.3.
TRANSFEKTION
VON
ES
ZELLEN
.
39
2.2.4.
KULTUR
DER
ENDOTHELZELLEN
UND
DURCHFUEHRUNG
DES
ADHAESIONSASSAYS
.
40
2.2.4.1
.
NACHWEIS
DER
CHEMOKINPRODUKTION
IN
ENDOTHELZELLEN
.
40
2.2.4.2.
DETEKTION
VON
CCL2
UND
CCL17
IM
ENZYME-IINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(ELISA).
40
2.2.4.3.
ETABLIERUNG
EINES
ELISAS
ZUR
DETEKTION
VON
CCL20
.
40
2.2.4.4.
ISOLATION
VON
LYMPHOZYTEN
AUS
DER
MILZ
.
41
2.2.4.5.
MAGNETISCHE
ZELLSORTIERUNG
.
41
2.2.4.6.
ADHAESIONSASSAY
.
42
2.2.4.7.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
.
42
2.2.4.8.
UNTERSUCHUNG
DER
TRANSMIGRATION
VON
LYMPHOZYTEN
IM
TRANSMIGRATIONSASSAY
.
43
2.2.4.9.
HISTOLOGISCHER
NACHWEIS
DER
CHEMOKINPRODUKTION
IN
BEND.3
ZELLEN.
44
5
2.2.5.
INFEKTION
VON
CCR6
DEFIZIENTEN
MAEUSEN
MIT
L.
MAJOR
.
45
2.2.5.1
.
IN
VIVO
INFEKTION
.
45
2.2.5.2.
ISOLATION
VON
ZELLEN
AUS
FUSSPFOTEN
UND
LYMPHKNOTEN
.
45
2.2.5.3.
MESSUNG
DER
T
ZELLPROLIFERATION
.
46
3.
ERGEBNISSE
.
47
3.1.
HERSTELLUNG
EINER
CCL20-DEFIZIENTEN
MAUSMUTANTE
.
47
3.1.1.
ANALYSE
DER
CCL20
GENSTRUKTUR
UND
KLONIERUNG
DES
DELETIONSVEKTORS
.
47
3.1.2.
TRANSFEKTION
DER
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
.
54
3.1.3.
ETABLIERUNG
EINES
CCL20
DEFIZIENTEN
MAUSSTAMMS
AUS
C57BL/6
ES
ZELLEN.
3.2.
ROLLE
VON
CC
CHEMOKINEN
BEI
ADHAESION
VON
LYMPHOZYTEN
IM
IN
VITRO
MODELL.
60
3.2.1.
UNTERSUCHUNG
DER
CHEMOKINEXPRESSION
DURCH
DIE
ZELLLINIE
BEND.3
.
61
3.2.2.
ADHAESION
VON
LYMPHOZYTEN
AN
ENDOTHELZELLEN
.
65
3.2.3.
CHEMOKINREZEPTOR
EXPRESSION
AUF
B
ZELLEN
.
70
3.2.4.
CHARAKTERISIERUNG
DER
ADHAERIERTEN
B
ZELLEN
.
72
3.2.5.
CCL20
VERMITTELT
DIE
ADHAESION
VON
B
ZELLEN
AN
BEND.3
ZELLEN
.
74
3.3.
DIE
ROLLE
VON
CCL20
UND
CCR6
BEI
DER
REKRUTIERUNG
VON
LYMPHOZYTEN
IM
INFEKTIONSMODELL
DER
LEISHMANIOSE
.
76
3.3.1.
DER
KLINISCHE
VERLAUF
DER
INFEKTION
.
76
3.3.2.
DIE
ENTWICKLUNG
DER
ZELLULAEREN
IMMUNANTWORT
GEGEN
L.
MAJOR
.
77
3.3.3.
DIE
ENTSTEHUNG
VON
EFFEKTOR
T
ZELLEN
IN
CCR6-NEGATIVEN
TIEREN
.
79
4.
DISKUSSION
.
81
4.1.
DIE
FUNKTIONSANALYSE
DER
CCL20
EXPRESSION
DURCH
AKTIVIERTE
ENDOTHELZELLEN
.
82
4.2.
HERSTELLUNG
EINES
CCL20-DEFIZIENTEN
TIERMODELLS
.
86
4.3.
UNTERSUCHUNG
DER
LEISHMANIENINFEKTION
IM
CCR6-DEFIZIENTEN
MAUSMODELL
.
87
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
91
6.
ANHANG
.
93
6.1.
ANTIKOERPER
.
93
6.2.
OLIGONUKLEOTIDE
.
94
6.3.
ABKUERZUNGEN
.
96
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
97 |
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