Identifizierung, funktionelle Charakterisierung und Gewebsverteilung des murinen hyperpolarisationsaktivierten zyklonukleotidgesteuerten Kationenkanals mHCN1:
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2002
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INHALTSANGABE
5
INHALT
J* EINLEITUNG 7
1.1. BIOPHYSIKALISCHE EIGENSCHAFTEN VON I
H 7
1.1.1. AKTIVIERUNG DURCH HYPERPOLARISATION 7
1.1.2. MODULATION DURCH ZYKLISCHE NUKLEOTIDE 9
1.1 3. SELEKTIVITAET FUER NATRIUM UND KALIUM 9
1.2. IH IN VERSCHIEDENEN GEWEBEN 10
1.2.1. IH IM ERREGUNGSBILDUNGS- UND -LEITUNGSSYSTEM DES HERZENS 10
1.2.2. IH IN DER ARBEITSMUSKULATUR DES HERZENS 12
1
.
2
.
3
.
IH IN NEURONALEM GEWEBE 12
1
.
2
.
4
.
IH IN SONSTIGEN GEWEBEN 13
13. ZIEL DIESER ARBEIT 14
2,
MATERIAL UND METHODEN 15
2.1. ARBEIT MIT BAKTERIEN 15
2.1.1. VERWENDETER STAMM 15
2.13. NAEHRMEDIEN UND ANTIBIOTIKA 15
2.1.3. KULTIVIERUNG 16
2.2. VERWENDETE PLASMIDE 16
23. TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 17
23
.
1
.
PRAEPARATION VON KOMPETENTEN BAKTERIENZELLEN 17
233. TRANSFORMATION VON
E. COLI
18
2.4. REINIGUNG UND QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN 18
2
.
4
.
1
.
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON NUKLEINSAEUREN 18
2
.
43
.
PRAEZIPITATION 19
2
.
43
.
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION 19
23. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA 19
23.1. KOCHSCHNELLTEST NACH HOLMES UND QUIGLY 19
233. ALKALISCHE LYSE MIT SAEULENCHROMATOGRAPHIE 20
2.6. AUFTRENNUNG UND ISOLIERUNG VON DNA-FRAGMENTEN 20
2.6.1. POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (PAGE) 21
2
.
63
.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 21
2
.
63
.
ELEKTROELUTION 22
2.7. ENZYMATISCHE MODIFIKATION VON DNA 22
2
.
7
.
1
.
RESTRIKTIONSENZYME 22
2.73. ALKALISCHE PHOSPHATASE 23
2
.
73
.
AUFFUELLREAKTION 23
2.7.4. T4-DNA-LIGASE 23
2.8. POLYMERASEKETTENREAKTION (PCR) 24
2.9. SEQUENZIERUNG VON DNA 25
2.9.1. SEQUENZREAKTION MIT RADIOAKTIV MARKIERTEN NUKLEOTIDEN 25
2.93. AUTOMATISCHE SEQUENZIERUNG MIT FLUORESZENZMARKIERTEN PRIMERN 27
2.10. HERSTELLUNG 3 2P.MARKIERTER SONDEN 28
2.11. NORTHERN BLOT-ANALYSE 28
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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6
INHALTSANGABE
2.12.
LN
SITU-HYBRIDISIERUNG 30
2.12.1. VERWENDETE LOESUNGEN 30
2
.
123
.
HERSTELLUNG DER RNA-SONDEN 31
2
.
123
.
ANFERTIGUNG VON GEWEBESCHNITTEN 32
2
.
12
.
4
.
STANDARDPROTOKOLL DER LN
'/-HYBRIDISIERUNG 33
2
.
123
.
FILMEMULSION 34
2.12.6. HISTOLOGISCHE FAERBUNGEN 35
2
.
12
.
7
.
MIKROSKOPIE UND PHOTOGRAPHIE 35
2
.
13
.
ARBEIT MIT EUKARYOTEN ZELLEN 35
2
.
13
.
1
.
EUKARYOTE ZELLINIE 36
2
.
133
.
NAEHRMEDIUM 36
2
.
133
.
KULTUR 36
2
.
13
.
4
.
TRANSFEKTION VON EUKARYOTEN ZELLEN NACH DER CALCIUMPHOSPHAT-METHODE 37
2
.
14
.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN 38
2T
ERGEBNISSE 39
3
.
1
.
KLONIERUNG DER CDNA VON MHCN 1 AUS DEM GEHIRN DER MAUS 39
3
.
2
.
ELEKTROPHYSIOLOGISCHE CHARAKTERISIERUNG VON MHCNL 43
3
.
2
.
1
.
AKTIVIERUNG DURCH HYPERPOLARISATION 43
3
.
2
.
2
.
MODULATION DURCH ZYKLISCHE NUKLEOTIDE 44
3
.
23
.
IONENLEITFAEHIGKEIT 45
3
.
3
.
UNTERSUCHUNG DER GEWEBSEXPRESSION VON MHCN 1 -3 45
33
.
1
.
NORTHERN BLOT 45
333.
LN
'/-HYBRIDISIERUNG 46
4I
DISKUSSION 52
4.1. STRUKTUR VON MHCNL 52
4
.
2
.
IONENSELEKTIVITAET 53
43
.
MODULATION DURCH ZYKLISCHE NUKLEOTIDE 54
4
.
4
.
AKTIVIERUNG DURCH HYPERPOLARISATION 55
4
.
5
.
LN
/-HYBRIDISIERUNG 56
4
.
5
.
1
.
LN
/-HYBRIDISIERUNG IM HERZEN 56
4
.
53
.
IN
'/-HYBRIDISIERUNG IM GEHIRN 56
ZUSAMMENFASSUNG
61
4A
ANHANG 63
6
.
1
.
NOMENKLATUR VON HCN-KANAELEN 63
6
.
2
.
VERWENDETE PRIMER 64
6
.
3
.
VERWENDETE ABKUERZUNGEN 65
2T
LITERATURVERZEICHNIS 66
DANKSAGUNG 73
LEBENSLAUF 74 |
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