Strukturelle und funktionelle Untersuchung der Promotorregionen der menschlichen PAX3-, PAX6- und PAX7-Gene: Bedeutung von Polymorphismen für schizophrene Erkrankungen
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN.8
1. EINLEITUNG.10
1.1. DIE FAMILIE DER
PAX-GENE.10
1.2.
PAX3, PAX6 UND PAX7.12
1.2.1. PAX3, PAX6 UND PAX7 IN DER NEUROGENESE.12
1.3.
PAX3, PAX7 UND SOMITOGENESE.16
1.4. ORGANOGENESE UND SINNESORGANE.18
1.5.
PAX3, PAX 7 UND ONCOGENESE.-.19
1.6. NEUROENTWICKLUNGSHYPOTHESE DER SCHIZOPHRENIE.19
1.7. ASSOZIATIONSSTUDIEN: EINE STRATEGIE FUER DIE IDENTIFIZIERUNG DER
KANDIDATENGENE
BEI KOMPLEXEN ERKRANKUNGEN.22
2. MATERIAL UND METHODEN.24
2.1. MATERIAL. 24
2.1.1. PATIENTEN UND GESUNDE PROBANDEN.24
2.1.2. ZELLLINIEN.24
2.1.3. BAKTERIENSTAEMME.25
2.1.4. BIBLIOTHEKEN.25
2.1.5. VEKTOREN.25
2.1.6. SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE.25
2.1.7. CHEMIKALIEN UND SONSTIGE REAGENZIEN.26
2.1.8. REAGENZIENSAETZE (YYK/FS").28
2.1.9. STERILISATION.29
2.1.10. PUFFER UND STAMM LOESUNGEN.29
2.1.11. MEDIEN, AGARPLATTEN UND ANTIBIOTIKA.344
2.1.11.1. MEDIEN FUER BAKTERIEN.344
2.1.11.2. ANTIBIOTIKA.34
2.1.11.3. X-GAL-PLATTEN.34
2.1.12. MEDIEN FUER ZELLKULTUR.355
2.1.13. GERAETE.YY.35
2.1.14. GEBRAUCHSWAREN.36
2.2. METHODEN.37
2.2.1. ISOLIERUNG VON NUKLEINSAEUREN.37
2.2.1.1. ISOLIERUNG VON GENOMISCHER DNA AUS GEWEBE.37
2.2.1.2. ISOLIERUNG GROESSERER MENGEN VON PLASMID-DNA.38
2.2.1.3. MINIPRAEPARATION VON PLASMID-DNA.39
2.2.1.4. PLASMID-MINIPRAEPARATION NACH QIAGEN-PROTOKOLL.39
2.2.1.5. ISOLIERUNG VON PAC-DNA IM GROSSEN MASSSTAB.40
2.2.1.6. ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA.41
2.2.1.7. ISOLIERUNG VON POLY(A)^-RNA.42
2.2.1.8. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND RNA.42
2.2.2. ENZYMATISCHE MODIFIKATION UND KLONIERUNGSTECHNIKEN VON DNA.43
2.2.2.1. DNA-HYDROLYSE MIT RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN.43
2.2.2.2. DEPHOSPHORYLIERUNG VON LINEARISIERTEN PLASMIDEN.44
2.2.2.3. LIGATION EINES DNA-INSERTS IN EINEN PLASMID-VEKTOR.44
2.2.2.4. KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN.44
2.2.2.5. HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN.45
2.2.2.6. HITZETRANSFORMATION VON BAKTERIEN.46
22.2.7. ELEKTROPORATION.46
5
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2.3. GELELEKTROPHORESE VON DNA UND RNA.47
2.2.3.1. AGAROSE-GELELEKTROPHORESE.47
2.2.3.2. LAENGENSTANDARDS.47
2.2.3.3. PRAEPARATION VON DNA AUS AGAROSEGELEN.48
2.2.3.4. ELEKTROPHORESE VON RNA IM AGAROSEGE!.48
2.2.3.5. HOCHAUFLOESENDE POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE.49
2.2.4. TRANSFER VON DNA-FRAGMENTEN: SOUTHEM-BLOTTING.49
2.2.5. RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA-SONDEN. 50
2.2.6. AUFFEINIGUNG RADIOAKTIVER DNA-SONDEN.51
2.2.7. ENDMARKIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN UND 5'-DEPHOSPHORYLIERTE
DNA-LEITER.51
2.2.8. SYNTHESE RADIOAKTIV MARKIERTER RNA-SONDE.52
2.2.8.1. HERSTELLUNG DER RADIOAKTIV MARKIERTEN /VLYJ-RNA-PROBE FILR
RIBONUKLEASE-
PROTEKTIONSASSAY.52
2.2.9. HYBRIDISIERUNG RADIOAKTIVER SONDEN AN MEMBRANGEBUNDENER RNA.52
2.2.10. HYBRIDISIERUNG RADIOAKTIVER SONDEN AN MEMBRANGEBUNDENER DNA.53
2.2.11. DN A-SEQUENZIERUNG.53
2.2.11.1. RADIOAKTIVE SEQUENZIERUNG MIT [A-35S]DATP.54
2.2.11.2. NICHT-RADIOAKTIVE SEQUENZIERUNG. .54
2.2.12. POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR).55
2.2.13. RT-PCR.57
2.2.14. KOMPETITIVE PCR.57
2.2.14.1. KOMPETITIVE PCR FUER DIE QUANTIFIZIERUNG VON P/LTOE-MRNA.59
2.2.15. METHODEN ZUR BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTPUNKTES.60
2.2.15.1. 5'-RACE (5' RAPIDAMPLISSCATIONOF CDNA ENDS).60
2.2.15.2. PRIMER-EXTENSION-ANALYSE.63
2.2.15.3. RIBONUKLEASE-PROTEKTIONSASSAY.64
2.2.16. REPORTERGENASSAY.65
2.2.16.1. KULTIVIEREN VON ZELLEN.65
2.2.16.2. HERSTELLUNG DER REPORTERGENKONSTRUKTEN DES /VLO-PROMOTORS.65
2.2.16.3. HERSTELLUNG DA- REPORTERGENKONSTRUKTEN DES /VIAT-PROMOTORS.66
2.2.16.4. HERSTELLUNG DA REPORTERGENKONSTRUKTEN DES M40/F-PROMOTORS.67
2.2.16.5. TRANSFEKTION.67
2.2.16.6. LYSIS VON ZELLEN.68
2.2.16.7. LUCIFERASE-ASSAY.68
2.2.16.8. SS-GALAKTOSIDASE-ASSAY.68
2.2.16.9. PROTEINBESTIMMUNG.69
3. ERGEBNISSE.70
3.1. CHARAKTERISIERUNG UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MIT DEM
PAX6-GEN
ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS.--.
70
3.1.1. BESTIMMUNG DER ALLEIVERTEILUNG INNERHALB EINER KON TROLLGRUPPE.
70
3.1.2. FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MIT DEM PAX6-GEN ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS.72
3.2. ASSOZIATIONSANALYSE DER PAX6-LPR UND DER SCHIZOPHRENIE.74
3.3. STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER PROMOTORREGION
DES
MENSCHLICHEN P4X3-GENS--YYYYYY 77
3.3.1. ISOLIERUNG DER 5'-FLANKIERENDEN REGULATORISCHEN REGION DES
HUMANEN PAX3-GENS.77
3.3.2. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTSPUNKTES DES PAX3-GENS.79
3.3.2.1. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTSPUNKTES DES
PAX3-GENS MITTELS PRIMER-EXTENSION.79
3.3.2.2. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTSPUNKTES DES PAX3-GENS
MITTELS RIBONUKLEASE-
PROTEKTION-ANALYSE.80
3.3.3. PROMOTORAKTIVITAET UND ANALYSE DER REGULATORISCHEN ELEMENTE IN
PROMOTORREGION
DES PAX3-GOIS.83
3.3.3.1. COMPUTERGESTUETZE ANALYSE POTENTIELLER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR-BINDUNGSSTELLEN IN DER
PROMOTORREGION DES PAX3-GENS.83
3.3.3.2. ANALYSE DER PROMOTORAKTIVITAET DES PAX3-GENS.83
3.3.4. CHARAKTERISIERUNG UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MIT DEM
PAX3-GEN ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS.86
3.3.4.1. BESTIMMUNG DA- ALLELVERTEILUNG INNERHALB DER KONTROLLGRUPPE.87
3.3.4.2. FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MIT DEM PAX3-GEN ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS.88
6
INHALTSVERZEICHNIS
3.4. ASSOZIATIOIISANALYSE DER PAX3-LPR UND DER SCHIZOPHRENIE.89
3.5. STRUKTURELLE UND FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER PROMOTORREGION
DES
MENSCHLICHEN P/TY7-GENS.-.92
3.5.1. ISOLIERUNG DER 5'-FLANKIERENDEN REGULATORISCHEN REGION DES
HUMANEN
PAX7-GENS.92
3.5.2. EXPRESSIONSANALYSE DES PAX7-GENS.93
3.5.3. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTSPUNKTES DES PAX7-GENS.95
3.5.3.1. BESTIMMUNG DES TRANSKRIPTIONSSTARTSPUNKTES DES PAX7-GENS
MITTELS PRIMER-EXTENSION.95
3.5.3.2. 5'-RACE (5 '-RAPIDAMPLIFIKATION OF C-DNA ENDS).96
3.5.4. PROMOTORAKTIVITAET UND ANALYSE DER REGULATORISCHEN ELEMENTE IN
PROMOTORREGION
DES PAX7-GENS.97
3.5.5. CHARAKTERISIERUNG UND FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MIT DEM
PAX7-GEN ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS.101
3.5.5.1. BESTIMMUNG DER ALLELVERTEILUNG INNERHALB EINER
KONTROLLGRUPPE.101
3.5.5 2. FUNKTIONELLE UNTERSUCHUNG DES MIT DEM PAX7-GEN ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS.102
3.6. ASSOZIATIONSANALYSE DER PAX7-LPR UND DER SCHIZOPHRENIE.103
4. ANHANG: ASSOZIATIONSANALYSE DES MIT DEM
MAOA-GEN ASSOZIIERTEN
PROMOTORPOLYMORPHISMUS UND PSYCHISCHER ERKRANKUNGEN.105
5. DISKUSSION.110
5.1. PROMOTORREGION DES MENSCHLICHEN PAX3-GENS.110
5.2. PROMOTORREGION DES MENSCHLICHEN PAX7-GENS.114
5.3. POLYMORPHE REPETITIVE ELEMENTE IN DEN PROMOTORREGIONEN DER PAX3-,
PAX6-
UND PAX7-GENEN.117
5.4. ASSOZIATIONSANALYSEN VON POLYMORPHISMEN DER PAX3-, PAX6- UND PAX7-
PROMOTORREGIONEN MIT DER SCHIZOPHRENIEERKRANKUNG.124
6. ZUSAMMENFASSUNG.127
7. SUMMA .130
8. LITERATURVERZEICHNIS.132
9. LEBENSLAUF.1^9
10. DANKSAGUNG.130
7 |
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| title_sub | Bedeutung von Polymorphismen für schizophrene Erkrankungen |
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| topic_facet | Genanalyse Promotor Genetik Transkriptionsfaktor Schizophrenie Hochschulschrift |
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