Untersuchung zur T-Zell-Immunität bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie: Induktion Leukämie-spezifischer T-Zellen in vitro durch antigenpräsentierende Zellen
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
1
ABKFIRZUNGSVERZEICHNIS Y
1. EINLEITUNG
1.1 THEORETISCHE GRUNDLAGEN 1
1.1.1 AKUTE MYELOISCHE LEUKAEMIE (AML) 1
1.1.2 THERAPIEMOEGLICHKEITEN FUER PATIENTEN MIT AML 4
1.1.3 DENDRITISCHE ZELLEN (DC) UND ANTI-TUMORIMMUNITAET 8
1.1.4 ZYTOTOXISCHE T-LYMPHOZYTEN 12
1.1.5 IMMUNEVASIONS-MECHANISMEN ' 14
1.1.6 T-LYMPHOZYTEN UND DER MECHANISMUS DER T-ZELL-AKTIVIERUNG 17
1.1.7 IMMUNTHERAPEUTISCHE STRATEGIEN FUER DIE BEHANDLUNG DER AML 26
1.2 ZIELSETZUNG DER ARBEIT 30
2. MATERIAL UND METHODEN
2.1 MATERIAL
32
2.1.1 GERAETE * 32
2.1.2 ZELLKULTURMEDIEN UND REAGENZIEN 33
2.1.2.1 ZELLKULTURMEDIEN UND EINFRIERLOESUNG 33
2.1.2.2 ZELLKULTURZUSAETZE YY' 34
2.1.2.3 REAGENZIEN 34
2.1.3 ANTIKOERPER 35
2.1.3.1 ANTIKOERPER FUER DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE 35
2.1.3.2 ANTIKOERPER FUER DIE SELEKTION VON ZELLEN 35
2.1.3.3 ANTIKOERPER FUER DIE T-LYMPHOZYTEN-AKTIVIERUNG 35
2.1.3.4 ANTIKOERPER ZUR UNTERSUCHUNG DER MHC-RESTRINGIERTEN LYSE 35
2.1.4 ZELLMATERIAL 36
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVCRZEKHNB
_ D
2.2 METHODEN 36
2.2.1 ISOLIERUNG VON MONONUKLEAEREN ZELLEN 36
2.2.2 ZELLZAHLBESTIMMUNG 36
2.2.3 EINFRIEREN UND AUFRAUEN VON ZELLEN 37
2.2.3.1 EINFRIEREN , 37
2.2.3.2 AUFRAUEN 37
2.2.4 DIFFERENZIERUNG VON DC IN VITRO 37
2.2.4.1 KULTIVIERUNG VON DC AUS PATIENTEN-PERIPHEREN BLUT 37
MONONUKLEAEREN ZELLEN (PBMNC)
2.2.4.2 KULTIVIERUNG VON DC AUS GESUNDEN SPENDER-PBMNC 38
2.2.5 QUANTIFIZIERUNG DER DENDRITISCHEN ZELLAUSBEUTE 38
2.2.6 MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNG VON ZELLEN 39
2.2.7 PHAENOTYPISCHE ANALYSE VON ZELLEN 39
2.2.8 NACHWEIS DES LEUKAEMISCHEN KLONS 40
2.2.8.1 ANREICHERUNG VON CD83-POSITIVEN ZELLEN 40
2.2.8.2 FLUORESZENZ-IN-SITU-HYBRIDISIERUNG (FISH) 40
2.2.9 HERSTELLUNG VON FUSIONSZELLEN IN VITRO 42
\
2.2.9.1 FUSION VON DC MIT AML-BLASTEN 42
2.2.9.2 UEBERPRUEFUNG DER FUSIONSEFFEKTIVITAET 43
2.2.10 GEMISCHTE LYMPHOZYTENREAKTION (MLR) 44
/
2.2.10.1 ALLOGENE MLR 44
2.2.10.2 AUTOLOGE MLR 45
2.2.11 HERSTELLUNG VON ZYTOTOXISCHEN-T-LYMPHOZYTEN (CTL) -LINIEN IN
VITRO 46
2.2.11.1 GENERIERUNG VON LEUKAEMIE-SPEZIFISCHEN CTL-LINIEN 46
2.2.11.2 EXPANSION DER T-LYMPHOZYTEN VON AML-PATIENTEN 46
2.2.11.3 ZYTOTOXIZITAETSTEST 47
2.2.11.4 ANTIKOERPERBLOCKIERUNG
48
INHALTSVERZEICHNIS
_;_UI
2.2.11.5 IMMUNPHAENOTYPISIERUNG VON GENERIERTEN CTL 48
2.2.12 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN VON PERIPHEREN BLUT-LYMPHOZYTEN 48
(PBL) BEI AML-PATIENTEN UND GESUNDEN SPENDERN
2.2.12.1 PHAENOTYPISCHE ANALYSE DER T-LYMPHOZYTEN 48
2.2.12.2 INTRAZELLULAERE FAERBUNG DER T-ZELL-REZEPTOR (TCR) -ASSOZIIERTEN
49
ZETA-KETTE IN PBL
2.2.12.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR PROLIFERATIONSFAEHIGKEIT DER T-LYMPHOZYTEN 50
2.2.12.3.1 STIMULATIONSEXPERIMENTE 50
2.2.12.4 UNTERSUCHUNGEN ZUM ZYTOTOXISCHEN EFFEKTORSTATUS DER 51
T-LYMPHOZYTEN
2.2.12.5 ZYTOKINUNTERSUCHUNGEN MITTELS ELISA 52
2.2.13 STATISTISCHE AUSWERTUNG 53
3. ERGEBNISSE
3.1 EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN 54
3.1.1 GENERIERUNG VON DC AUS AML-BLASTEN IN VITRO 54
3.1.2 PHAENOTYPISCHE ANALYSE VON DC 58
3.1.3 DETEKTION VON GEN-UMLAGERUNGEN IN DC ZUM NACHWEIS IHRES 62
LEUKAEMISCHEN URSPRUNGS
3.1.4 FUNKTIONALITAET DER VON AML-PATIENTEN GENERIERTEN DC 63
3.1.4.1 FAEHIGKEIT ZUR ALLOGENEN STIMULATION / 63
3.1.4.2 NACHWEIS DER PRAESENTATION VON ANTIGENEN DURCH DC 65
3.1.5 ZYTOTOXIZITAET VON T-LYMPHOZYTEN, DIE DURCH STIMULATION MIT 67
"LEUKAEMISCHEN" DC GENERIERT WURDEN
3.1.6 GENERIERUNG VON FUSIONSZELLEN AUS DC UND AML-BLASTEN IN VITRO 71
3.1.7 FUNKTIONSANALYSE DER FUSIONSZELLEN 73
INHALTSVERZEICHNIS
IV
3.1.8 PHAENOTYPISCHE UNTERSUCHUNGEN VON PBL BEI AML-PATIENTEN 76
IM VERGLEICH ZU GESUNDEN SPENDERN
3.1.8.1 EXPRESSION DER TCR-ASSOZIIERTEN ZETA-KETTE IN PBL 76
3.1.8.2 ANALYSE DER CD28-EXPRESSION AUF PBL 77
3.1.9 UNTERSUCHUNGEN ZUR PROLIFERATION UND EFFEKTORFUNKTION VON CD28' 85
PBL BEI AML-PATIENTEN IM VERGLEICH ZU GESUNDEN SPENDERN
3.1.9.1 PROLIFERATION DER CD28' T-ZELLEN 85
3.1.9.2 ZYTOTOXISCHE FUNKTION UND ZYTOKINSEZEMIERUNG DER CD28' 87
T-ZELLEN
3.1.9.3 AKTIVIERUNGSZUSTAND DER CD28' T-ZELLEN 92
4. DISKUSSION
4.1 EXPERIMENTELLE UNTERSUCHUNGEN 95
4.1.1 GENERIERUNG VON DC AUS AML-BLASTEN IN VITRO 95
4.1.2 ZYTOTOXIZITAET VON T-LYMPHOZYTEN, DIE DURCH STIMULATION MIT 98
"LEUKAEMISCHEN" DC GENERIERT WURDEN
4.1.3 GENERIERUNG VON FUSIONSZELLEN AUS DC UND AML-BLASTEN IN VITRO 101
4.1.4 VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN VON PBL BEI AML-PATIENTEN UND 105
GESUNDEN SPENDERN
5. ZUSAMMENFASSUNG
/ 112
DANKSAGUNG
LITERATURVERZEICHNIS
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