Evolution mikrobieller Pathogenität: Salmonella-Pathogenitätsinsel-2 als Paradigma für horizontalen Gentransfer
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1
SALMONELLA
ALS KRANKHEITSERREGER 1
1.1.1 DIE PATHOGENESE VON SALMONELLA
INFEKTIONEN 2
1.1.2 ZELLULAERE GRUNDLAGEN DER PATHOGENESE VON SALMONELLOSEN 3
1.1.3 UEBERLEBEN UND REPLIKATION VON
SALMONELLA
INNERHALB VON
WIRTSZELLEN
4
1.2
SALMONELLA
BESITZT FUENF PATHOGENITAETSINSELN 5
1.3 TYP III-SEKRETIONSSYSTEME IN
SALMONELLA
6
1.4 DIE MOLEKULARE STRUKTUR VON SPI2 9
1.5 FUNKTION VON SPI2 UND SPI2-SUBSTRATPROTEINEN 10
1.6 TTSS ALS PARADIGMA DER EVOLUTION VON VIRULENZFAKTOREN IN
GRAM-NEGATIVEN BAKTERIEN 11
1.7 MECHANISMEN DES HORIZONTALEN GENTRANSFERS 12
1.8 WIRTSSPEZIFITAET INNERHALB DER GATTUNG
SALMONELLA
14
1.9 ZIEL DIESER ARBEIT 17
2 MATERIAL UND METHODEN 18
2.1 BAKTERIENSTAEMME UND KULTURBEDINGUNGEN 18
2.1.1 MINIMALMEDIEN ZUR BAKTERIENANZUCHT 21
2.1.2 PHAGEN-MEDIEN 22
2.2 GENETISCHE METHODEN 23
2.2.1 DNA-STANDARDMETHODEN 23
2.2.2 ERZEUGUNG EINER COSMIDBANK 23
2.2.3 P22-TRANSDUKTION 24
2.2.4 PHAGEN-ISOLIERUNG 24
2.2.5 AMPLIFIKATION VON DNA DURCH PCR 25
2.2.6 DELETIONEN MIT DEM YYONE-STEP INACTIVATION SYSTEM" (DAT-
SENKO & WANNER, 2000) 28
2.2.7 DNA-SEQUENZIERUNGEN 29
2.2.8 SOUTHERN-BLOT-HYBRIDISIERUNGEN 29
2.2.9 KOLONIE-BLOT 30
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.3 PROTEINBIOCHEMISCHE UND IMMUNOLOGISCHE METHODEN 31
2.3.1 WESTERN-BLOT-ANALYSE
31
2.3.1.1 SDS-PAGE 31
2.3.1.2 PROTEIN-TRANSFER UND IMMUNODETEKTION 31
2.3.1.3 ENTFERNUNG VON MEMBRANGEBUNDENEN ANTIKOERPERN 31
2.3.2 ABWASCH UND FAELLUNG VON PROTEIN-OBERFLAECHENSTRUKTUREN 32
2.4 ZELLKULTUR 33
2.4.1 KULTIVIERUNG VON EUKARYONTISCHEN ZELLEN UND INFEKTIONS
VERSUCHE 33
2.4.2 EVALUIERUNG DER INTRAZELLULAEREN REPLIKATION 33
2.4.3 DETEKTION VON PROTEIN-TRANSLOKATION DURCH IMMUNFLUORESZENZ 34
2.4.3.1 IN WESTERN-BLOT UND IMMUNFLUORESZENZ EINGESETZTE PRIMAER
ANTIKOERPER 34
2.5 MAUSINFEKTIONSMODELL 35
2.6 BIOINFORMATIK 36
2.6.1 DATENBANKRECHERCHEN UND SEQUENZABGLEICHE 36
3
ERGEBNISSE 37
3.1 IDENTIFIZIERUNG SALMONELLA-SPEZIFISCHER CHROMOSOMALER
REGIONEN 37
3.1.1 IDENTIFIZIERUNG NEUER SA/MONE//A-SPEZIFISCHER DNA-ELEMENTE 37
3.1.2 CHARAKTERISIERUNG DER NEUEN TRNA-ASSOZIIERTEN GENOMI-
SCHEN INSERTIONEN IN SALMONELLA 38
3.1.2.1 DIE GENETISCHE ORGANISATION DER TRNAPROL-REGION 39
3.1.2.2 DIE GENETISCHE ORGANISATION DER TRNAARGU-REGION 40
3.1.2.3 DIE GENETISCHE ORGANISATION DER TRNAARGW-REGION 41
3.1.2.4 DIE GENETISCHE ORGANISATION DER TRNAPHEU-REGION 43
3.1.3 DIE BASENZUSAMMENSETZUNG DER NEUEN TRNA-ASSOZIIERTEN
GENOMINSERTIONEN IN S. ENTERICA SEROVAR TYPHI 44
3.1.4 DIE PHYLOGENETISCHE VERTEILUNG DER TRNA-ASSOZIIERTEN
GENOM-INSERTIONEN 45
3.1.5 INSERTIONSSTELLEN DER TRNA-ASSOZIIERTEN ELEMENTE 49
3.1.6 DIE ROLLE DER TRNA-ASSOZIIERTEN ELEMENTE BEI DER VIRULENZ
VON SALMONELLA 51
II
INHALTSVERZEICHNIS
3.2 UNTERSCHIEDLICHE VERTEILUNG VON VIRULENZ-FAKTOREN ALS UR
SACHE DER WIRTSSPEZIFITAET VON SALMONELLA SPP.?
53
3.2.1 VERBREITUNG VON VIRULENZ-DETERMINANTEN INNERHALB DER SPE
ZIES S. BONGORI
53
3.2.
1.1
VERTEILUNG VIRULENZ-ASSOZIIERTER GENE
53
3.2.2 VERTEILUNG VON SPI2-EFFEKTOREN INNERHALB DER GATTUNG
SALMO
NELLA ALS MOEGLICHER HINWEIS AUF WIRTSSPEZIFITAET
55
3.2.2
.1
GENETISCHE ORGANISATION DER STE-LOCI 56
3.22.2
PHYLOGENETISCHE VERTEILUNG DER STE-GENE 58
3.2.2.3 VERTEILUNG DER STE-GENE INNERHALB VON S.
ENTERICA SUB
SPEZIES I
59
3.3 KLONIERUNG UND FUNKTIONELLER TRANSFER DES VIRULENZ-RELEVANTEN
TEILS VON SALMONELLA-PATHOGENITAETSINSEL 2 (SPI2) 61
3.3.1 VERSUCHE ZU MOEGLICHEN DNA-TRANSFERMECHANISMEN INNER
HALB DER GATTUNG SALMONELLA 61
3.3.2 IDENTIFIKATION DER INSERTIONSSTELLE VON SPI2 IN VERSCHIEDENEN
SALMONELLA-SUBSPEZIES 62
3.3.2.1 SPI2 IST STABIL IM GENOM VON S.
ENTERICA SEROVAR TYPHIMU-
RIUM INTEGRIERT 63
3.3.3 KLONIERUNG DES SPI2-SEKRETIONSSYSTEMS 64
3.3.4 ANALYSE DES WACHSTUMS DIVERSER REZIPIENTENSTAEMME IN
SPI2-INDUZIERENDEN BEDINGUNGEN 65
3.3.5 TRANSFER UND REGULATION DER EXPRESSION DES COSMID-KODIER-
TEN SPI2-SEKRETIONSAPPARATES IN SPI2-NEGATIVEN WIRTEN
66
3.3.6 UMKLONIERUNG DER SPI2-GENE VON P1-H4 IN EINEN VEKTOR MIT
EINFACHER KOPIENZAHL
68
3.3.7 REGULATION VON GENEXPRESSION UND SEKRETION PB
6
-KODIERTER
SPI2-PROTEINE IN S. BONGORI 70
3.3.8 SEKRETION DER COSMID-KODIERTEN SPI2-PROTEINE 71
3.3.9 VERMITTELT DER TRANSFER VON SPI2 DIE FAEHIGKEIT VON S.
BONGORI
ZUR REPLIKATION IM MAKROPHAGEN? 73
3.3.9.1 MIKROSKOPISCHE ANALYSE DER INTRAZELLUAEREN REPLIKATION VON S.
BONGORI [PB
6
] IN J774.A1-MAKROPHAGEN 74
3.3.9.2 ANALYSE DES INTRAZELLULAEREN UEBERLEBENS UND REPLIKATION VON
S. BONGORI [PB
6
] 75
3.3.10 SUCHE NACH WEITEREN FUER DIE INTRAZELLULAERE REPLIKATION
RELEVANTEN PROTEINEN AUSSERHALB SPI2 76
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.11 TRANSLOKATION VON SPI2-EFFEKTORPROTEINEN AUS S.
BONGORI IN
EUKARYONTISCHE ZIELZELLEN 77
3.3.11.1 KLONIERUNG VON
SIFA UND ETABLIERUNG IN S. BONGORI 77
3.3.11.2 S.
BONGORI [PB
6
]-VERMITTELTE SIF-BILDUNG IN EPITHELZELLEN 80
3.3.11.3 TRANSLOKATION EINES STE-PROTEINS DURCH DEN HETEROLOG EXPRI-
MIERTEN SPI2-SEKRETIONSAPPARAT 84
4 DISKUSSION 89
4.1 HORIZONTAL TRANSFERIERTE ELEMENTE IN
SALMONELLA 89
4.2 TRNA-GENE ALS ANKERPUNKTE FUER PATHOGENITAETSINSELN 91
4.3 GIBT DIE VERTEILUNG VON VIRULENZ-GENEN IN
SALMONELLA SPP.
EINEN HINWEIS AUF DIE WIRTSSPEZIFITAET? 95
4.4 KANN DAS SPI2-TTSS DEN SPI2-PHAENOTYP IM HETEROLOGEN
WIRT VERMITTELN? 98
4.4.1 DAS SPI2-TTSS ALS HETEROLOG EXPRIMIERTE SEKRETIONS
MASCHINE
101
4.5 DAS TYP ILL-SEKRETIONSSYSTEM DER SPI2 ALS KERN EINES VARIAB
LEN VIRULENZMODULS 104
5 AUSBLICK 109
6 ZUSAMMENFASSUNG 110
7 LITERATURVERZEICHNIS 112
8 LEBENSLAUF
9 DANKSAGUNG
IV |
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