Biosynthese des Metallzentrums von [NiFe]-Hydrogenasen aus E. coli: Analyse zweier Reifungsenzyme
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
EINLEITUNG
1
DAS
AKTIVE
ZENTRUM
DER
HYDROGENASEN
1
PHYSIKALISCHE
UND
CHEMISCHE
EIGENSCHAFTEN
VON
CO
UND
CN
4
CN,
EIN
SOFTWECHSELPRODUKT
IN
BIOLOGISCHEN
SYSTEMEN
4
CO
BILDENDE
STOFFWECHSELWEGE
IN
DER
BIOLOGIE
9
BEFUNDE
ZUR
CO
UND
CN-BILDUNG
IN
DER
HYDROGENASEREIFUNGSKASKADE
13
MATERIAL
UND
METHODEN
17
1.
MIKROBIOLOGISCHE
METHODEN
17
1.1.
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
17
1.2.
NAEHRMEDIEN
UND
SUPPLEMENTE
19
1.3.
AEROBE
UND
ANAEROBE
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
20
1.4.
BESTIMMUNG
DER
ZELLDICHTE
20
2.
GENETISCHE
METHODEN
20
2.1.
TRANSFONNATION
VON
E.
COLI-ZELLEN
20
2.2.
INTEGRATION
VON
DEFINIERTEN
MUTATIONEN
IN
DAS
E.
CO/I-CHROTNOSOM
20
3.
PHYSIOLOGISCHE
METHODEN
21
3.1.
HJIBENZYLVIOLOGEN-OXIDOREDUKTASE-AKTIVITAET
VON
GANZEN
ZELLEN
21
3.2.
NACHWEIS
DER
FAEHIGKEIT
AUF
HJ-BILDUNG
21
3.3.
BESTIMMUNG
DER
AKTIVITAETEN
DER
HYDROGENASEN
VON
E.
COLI
2
1
4.
MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
22
4.1.
LISTE
VERWENDETER
OLIGONUKLEOTIDE
22
4.2.
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
23
4.3.
AUFREINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
23
4.4.
ENZYMATISCHE
IN
VIRRO-REAKTIONEN
AN
DNA
23
4.5.
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
24
4.6.
AMPLIFIKATION
VON
DNA
MIT
HILFE
DER
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
24
4.7.
GEZIELTE
MUTAGENESE
24
5.
REINIGUNG
VON
PROTEINEN
25
INHALTSVERZEICHNIS
5.1.
REINIGUNG
VON
HYBD
UND
HYPC-PROTEIN
25
5.2.
REINIGUNG
VON
STREP-TAGLL-PROTEINEN
25
5.3.
REINIGUNG
VON
HYPF-PROTEIN
25
6.
ANALYTISCHE
STANDARDMETHODEN
27
6.1.
AUFTRENNUNG
VON
DNA
IN
AGAROSEGELEN
27
6.2.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
27
6.3.
AUFTRENNUNG
VON
PROTEINEN
UNTER
NICHT
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
28
6.4.
FAERBUNG
DER
AUFGETRENNTEN
PROTEINE
28
6.4.1.
SILBERFAERBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
28
6.4.2.
COOMASSIE
FAERBUNG
VON
SDS-POLYACRYLAMIDGELEN
28
6.4.3.
ENZYMATISCHE
AKTIVITAETSFAERBUNGEN
VON
GELEN
NACH
NICHT
DENATURIERENDER
GELELEKTROPHORESE
28
6.5.
BESTIMMUNG
DES
PROTEINGEHALTS
29
6.6.
BESTIMMUNG
DER
NUKLEINSAEURE-KONZENTRATION
29
7.
BIOCHEMISCHE
METHODEN
29
7.1.
IN
VITRO
PROZESSIERUNG
VON
HYCE
29
7.2.
BESTIMMUNG
DER
CARBAMOYLPHOSPHAT-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
30
7.3.
BESTIMMUNG
DER
ATP
HYDROLYSIERENDEN
AKTIVITAET
VON
HYPF
30
7.4.
UNTERSUCHUNG
DER
PYROPHOSPHAT-ATP-AUSTAUSCH
REAKTION
DURCH
ADSORPTION
AN
AKTIVKOHLE
30
8.
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
31
8.1.
IMMUNOBLOTANALYSEN
31
9.
BIOPHYSIKALISCHE
METHODEN
31
10.
COMPUTER
UNTERSTUETZTES
ARBEITEN
32
10.1.
DATENVERARBEITUNG
32
10.2.
BIOINFORMATISCHE
METHODEN
32
11.
BEZUGSQUELLE
VON
ENZYMEN
UND
CHEMIKALIEN
32
ERGEBNISSE
34
A.
1
BIOINFORMATISCHE
UNTERSUCHUNG
DER
MOEGLICHEN
FUNKTION
DER
HYP-PROTEINE
34
A.2
ANALYSE
DER
SEQUENZEN
DER
HYPA-,
HYPB-
UND
HYPC-PROTEINE
38
A.3
ANALYSE
DER
SEQUENZEN
DES
HYPD-PROTEINS
39
A.4
ANALYSE
DER
SEQUENZEN
DES
HYPE-PROTEINS
40
INHALTSVERZEICHNIS
A.5
ANALYSE
DER
SEQUENZ
DES
HYPF-PROTEINS
42
A.6
ANALYSE
DER
SEQUENZEN
WEITERER
FUER
DIE
CO/CN-BIOSYNTHESE
RELEVANTER
PROTEINE
46
A.7
ZIELSETZUNG
AUFBAUEND
AUF
DER
SEQUENZANALYSE
46
B.
ROLLE
VON
CARBAMOYLPHOSPHAT
IN
DER
REIFUNG
DER
GROSSEN
UNTEREINHEIT
DER
[NIFEJ-HYDROGENASEN
AUS
E.
COLI
48
B.L
PHYSIOLOGISCHE
BEDEUTUNG
UND
SYNTHESE
DES
CARBAMOYLPHOSPHATS
48
B.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
BEDEUTUNG
DES
CARBAMOYLPHOSPHATS
FUER
DIE
HYDROGENASEREIFUNG
52
B.3
KONSTRUKTION
EINES
E.
COLI
MC4100-DERIVATES
MIT
DELETION
IM
CARAB-LOCUS
52
B.4
PHAENOTYPISCHE
CHARAKTERISIERUNG
DER
CARAS-DELETIONSMUTANTEN
53
B.5
UNTERSUCHUNG
DER
H
2
-BILDUNG
DURCH
DEN
ACARAB-STAMM
57
B.6
METALLORGANISCHE
MODELREAKTIONEN
DIE
ZUR
BILDUNG
VON
CN
UND
CO
AUS
CARBAMOYLPHOSPHAT
FUEHREN
KOENNEN
59
B.7
IST
CARBAMOYLPHOSPHATS
EIN
SUBSTRAT
FUER
DAS
HYPF-PROTEIN?
62
C.
BIOCHEMISCHE
CHARAKTERISIERUNG
UND
STRUKTUR-FUNKTIONS-ANALYSE
DES
HYPF-PROTEINS
63
ALLGEMEINES
UND
HISTORISCHER
RUECKBLICK
63
C.
1.
REINIGUNG
VON
HYPF
64
C.2.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
ENZYMATISCHEN
AKTIVITAET
DES
HYPF-PROTEINS
65
C.2.
1.
CARBAMOYLPHOSPHAT-PHOSPHATASE-AKTIVITAETSFILRBUNG
VON
HYPF
IN
NICHT
DENATURIERENDEN
POLYACRYLAMIDGELEN
65
C.2.2.
ETABLIERUNG
EINES
ENZYMATISCHEN
ANSATZES
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
CARBAMOYLPHOSPHAT-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
VON
HYPF
66
C.2.3.
SUBSTRATSPEZIFITAET
DES
HYPF-PROTEINS
68
C.2.4.
BESTIMMUNG
DER
KINETISCHEN
PARAMETER
DER
CARBAMOYLPHOSPHAT
PHOSPHATASE-AKTIVITAET
VON
HYPF
69
C.2.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
CARBAMOYLPHOSPHAT-PHOSPHATASE-AKTIVITAET
VON
HYPF
71
C.3.
UNTERSUCHUNGEN
EINER
CARBAMOLYPHOSPHAT
VERMITTELTEN
ATP-HYDROLYSE
DURCH
HYPF
72
INHALTSVERZEICHNIS
C.3.1.
KINETIK
DER
ATP-HYDROLYSE
74
C.3.2.
BESTIMMUNG
DER
CARBAMOYLPHOSPHAT-AFFINITAET
DES
HYPF-PROTEINS
UEBER
DIE
ATP HYDROLYSIERENDE
AKTIVITAET
76
C.4.
PYROPHOSPHAT-ATP-AUSTAUSCH-REAKTION
KATALYSIERT
DURCH
DAS
HYPF-PROTEIN
77
C.5.
STRUKTUR-FUNKTIONS
ANALYSE
VON
VERSCHIEDENEN
HYPF-VARIANTEN
79
C.6.
1
GEZIELTE
MUTAGENES
DES
HYPF-GENS
79
C.6.2
KONSTRUKTION
VON
DHP-F2
81
C.6.3
MUTATIONSANALYSE
VON
HYPF
82
C.6.4
AUSWIRKUNG
DER
MUTATIONEN
AUF
DIE
CARBAMOYLPHOSPHAT-PHOSPHATASE
AKTIVITAET
VON
HYPF
83
C.7
UNTERSUCHUNG
ZUM
METALLGEHALT
DES
HYPF-PROTEINS
84
C.8
DER
ERSTE
UND
DER
LETZTE
SCHRITT
IN
DER
REIFUNG
DER
GROSSEN
UNTEREINHEITEN
DER
[NIFE]-HYDROGENASEN
87
R
D.
STRUKTUR
UND
FUNKTION
DER
AN
DER
HYDROGENASE-REIFUNG
BETEILIGTEN
ENDOPEPTIDASEN
88
D.
1.
KRISTALLZUCHT
UND
DATENSAMMLUNG
88
D.2.
KRISTALLSTRUKTUR
DER
PROTEASE
HYBD
AUS
E.
COLI
89
D.3.
VERGLEICH
MIT
METZINCINEN
92
D.4.
WICHTIGE
ERKENNTNISSE
AUS
DER
KRISTALLOGRAPHISCHEN
STRUKTUR
VON
HYBD
93
D.5.
GEREINIGTE
ENDOPEPTIDASEN
HYBD
UND
HYCL
ENTHALTEN
KEINEN
METALLCOFAKTOR
94
D.6.
DIE
PROTEASE
HYCL
BILDET
KEINEN
STABILEN
KOMPLEX
MIT
NICKEL
AUS
95
D.7.
ANALYSE
ZUM
EINFLUSS
VON
INHIBITOREN
UND
METALLEN
AUF
DIE
PROZESSIERUNGSREAKTION
KATALYSIERT
DURCH
HYCL
96
DISKUSSION
98
HERKUNFT
DER
NIEDERMOLEKULAREN
LIGANDEN
98
BETEILIGUNG
DER
HYP-PROTEINE
AN
DER
SYNTHESE
DER
EISEN-LIGANDEN
101
WIE
ERFOLGT
DIE
CO
UND
CN
BIOSYNTHESE?
103
WIE
ERFOLGT
DER
TRANSPORT
UND
DIE
ANLAGERUNG
DER
CO-
UND
CN-LIGANDEN
AN
DAS
EISEN?
107
HYBD,
EINE
REIFUNGSPROTEASE
MIT
METALLBINDETASCHE
ZUR
ERKENNUNG
DES
NICKELS
IM
HYDROGENASE-APOPROTEIN
107
ZUSAMMENFASSUNG
110
INHALTSVERZEICHNIS
LITERATURVERZEICHNIS
112
ANHANG
132 |
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