Verfügbarkeit: DNA-Vakzinierung mit Idiotyp-Zytokin-Fusionskonstrukten gegen Lymphome im Mausmodell

DNA-Vakzinierung mit Idiotyp-Zytokin-Fusionskonstrukten gegen Lymphome im Mausmodell:

Gespeichert in:

Bibliographische Detailangaben
1. Verfasser:	Edbauer, Dieter 1976- (VerfasserIn)
Format:	Buch
Sprache:	German
Veröffentlicht:	2002
Schlagworte:	Hochschulschrift
Online-Zugang:	Inhaltsverzeichnis
Beschreibung:	München, Univ., Med. Fak., Diss., 2002
Beschreibung:	III, 113 S. Ill., graph. Dkarst.

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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 1.1 LYMPHOME . 1 1.1.1 NON-HODGKIN-LYMPHOME . 1 1.1.2 NEUE THERAPIEANSAETZE BERUECKSICHTIGEN DIE TUMORBIOLOGIE . 3 1.2 TUMORANTIGE . 5 1.2.1 DER IDIOTYP ALS MODELL-TUMORANTIGEN . 5 1.2.2 IDENTIFIKATION VON TUMORANTIGENEN . 7 1.3 GENETISCHE VAKZINIERUNG . 8 1.3.1 ZELLULAERE MECHANISMEN DER GENETISCHEN VAKZINIERUNG . 9 1.3.2 IMMUNSTIMULATORISCHE DNA-SEQUENZEN (ISS) . 10 1.3.3 ZYTOKINE SIND POTENTE IMMUNMODULATOREN . 10 1.4 ZIEL DER ARBEIT . 15 2 MATERIALIEN 16 2.1 ZELLLINIEN, BAKTERIENSTAEMME UND VERSUCHSTIERE . 16 2.2 PLASMIDE . 16 2.3 ANTIKOERPER . 17 2.4 ENZYME . 17 2.5 CHEMIKALIEN, GERAETE UND ANDERE MATERIALIEN . 18 3 METHODEN 22 3.1 KLONIERUNG UND VERMEHRUNG VON DNA IN E. COLI . 22 3.1.1 BAKTERIENHALTUNG . 22 3.1.2 HERSTELLUNG TRANSFORMATIONSKOMPETENTER BAKTERIEN . 23 3.1.3 TRANSFORMATION VON PLASMID-DNA IN KOMPETENTE E.COLI . 23 3.2 DNA-TECHNIKEN . 24 3.2.1 AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE, GELEXTRAKTION . 24 3.2.2 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION . 24 3.2.3 KONZENTRATIONSBESTIMMUNG VON DNA UND RNA . 25 3.2.4 PLASMIDPRAEPERATION AUS E. COLI . 25 3.2.5 RESTRIKTIONS-VERDAU . 25 3.2.6 GLAETTEN UEBERHAENGENDER ENDEN . 26 3.2.7 DEPHOSPHORYLIERUNG . 26 3.2.8 PHOSPHORYLIERUNG VON OLIGONUKLEOTIDEN . 26 3.2.9 LIGATION . 26 3.2.10 DNA-SEQUENZIERUNG . 27 3.3 PCR-METHODEN . 27 3.3.1 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA . 27 3.3.2 ERSTSTRANG-SYNTHESE VON CDNA FUER RT-PCR . 27 3.3.3 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) . 27 II INHALTSVERZEICHNIS 3.3.4 5 ' RACE-PCR-RAPID AMPLIFICATIONOFCDNAENDS . 28 3.3.5 PCR-MUTAGENESE . 29 3.3.6 KLONIERUNG VON PCR-PRODUKTEN . 29 3.4 PROTEIN-ARBEITEN . 29 3.4.1 ZELLLYSATE . 29 3.4.2 IMMUNPRAEZIPITATION . 30 3.4.3 SDS-PAGE ELEKTROPHORESE: GLYCIN-GELE . 30 3.4.4 SDS-PAGE ELEKTROPHORESE: TRICIN-GELE . 31 3.4.5 COOMASSIEFAERBUNG . 32 3.4.6 SILBERFAERBUNG . 32 3.4.7 WESTERN-BLOT, IMMUNODETEKTION . 33 3.4.8 ELISA (ENZYME-LINKED-IMMUNOSORBENT-ASSAY) . 34 3.4.9 35S MARKIERUNG VON PROTEINEN, AUTORADIOGRAPHIE . 35 3.5 ZELLKULTUR - HALTUNG EUKARYONTISCHER ZELLEN . 36 3.5.1 KULTIVIERUNG VON ZELLLINIEN . 36 3.5.2 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL . 36 3.5.3 ADHAERENTE ZELLEN . 36 3.5.4 SUSPENSIONSZELLEN . 37 3.5.5 EINFRIEREN VON ZELLEN . 37 3.5.6 CALCIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION VON ADHAERENTEN ZELLEN . 37 3.5.7 PRAEZIPITATION VON DNA AUF GOLD-MIKROPARTIKEL . 38 3.5.8 ISOLATION VON PBL UEBER FICOLL-GRADIENTEN . 38 3.5.9 GENERIERUNG VON PHA-BLASTEN . 38 3.5.10 3H-THYMIDINEINBAU ZUM NACHWEIS DER ZELLPROLIFERATION . 39 3.6 ANALYSE DER ZELLULAEREN IMMUNANTWORT . 39 3.6.1 MILZPRAEPARATION ZUR LYMPHOZYTENKULTUR . 39 3.6.2 RESTIMULATION VON SPLENOZYTEN IN VITRO . 40 3.6.3 T-ZELLPROLIFERATIONSASSAY . 40 4 ERGEBNISSE 41 4.1 IDIOTYP-KLONIERUNG . 41 4.1.1 KONSENSUS-PRIMER ERMOEGLICHEN DIE KLONIERUNG DES BCL1 IDIOTYPS . . 41 4.1.2 5 ' -RACE-PCR ZUR KLONIERUNG DES A20 IDIOTYPS . 42 4.1.3 ANALYSE DER A20-VL CDR-SEQUENZ . 43 4.1.4 FUSION DER VARIABLEN DOMAENEN ZU SINGLE-CHAIN FRAGMENTEN . 43 4.2 KLONIERUNG VON FUSIONSKONSTRUKTEN MIT IMMUNOGENEN CARRIERN UND ZYTOKINEN 44 4.2.1 KLONIERUNGSSTRATEGIE . 46 4.2.2 AUSWAHL UND KLONIERUNG DER VERWENDETEN ZYTOKINE . 47 4.2.3 KLONIERUNG DES TETANUS TOXIN FRAGMENT C AUS CLOSTRIDIUM TETANI . . 50 4.3 ANALYSE DER FUSIONSKONSTRUKTE IN VITRO IN HEK293 ZELLEN . 52 4.3.1 IDIOTYP SCFV OHNE ZYTOKINANTEIL SIND NUR IM ZELLLYSAT NACHWEISBAR . . 52 4.3.2 KLONIERUNG EINER STABILEN SEZEMIERTEN NEGATIVKONTROLLE . 53 4.3.3 EXPRESSIONSNACHWEIS IN ELISA UND WESTERN BLOT . 54 4.3.4 DIE ZYTOKINE SIND ALS FUSIONSPROTEIN BIOAKTIV . 56 4.3.5 IDIOTYP SCFV SIND KORREKT GEFALTET . 59 4.4 OPTIMIERUNG DES VAKZINIERUNGSWEGES AM BEISPIEL VON HBSAG . 60 4.5 TIERMODELL . 62 INHALTSVERZEICHNIS III 4.5.1 MINIMALE TUMORDOSIS VON A20 UND BCL1 . 62 4.5.2 PROTOKOLL ZUR PROTEKTIVEN VAKZINIERUNG . 63 4.5.3 UNTERSUCHUNG DER HUMORALEN IMMUNANTWORT . 64 4.5.4 PROLIFERATIONSASSAY AUS MILZZELLEN GEIMPFTER TIERE . 65 4.5.5 HBSAG INDUZIERT EINE STARKE ZELLULAERE IMMUNANTWORT . 68 4.5.6 PROTEKTIVER EFFEKT . 68 5 DISKUSSION 70 5.1 KLONIERUNG DER LYMPHOM-IDIOTYPEN, DNA-VAKZINIERUNG . 70 5.1.1 KLONIERUNG VON LYMPHOM SCFV MIT RACE-PCR . 70 5.1.2 MECHANISMEN DER DNA-VAKZINIERUNG . 71 5.2 EXPRESSION DER FUSIONSKONSTRUKTE IN VITRO . 73 5.2.1 ZYKTOKINE ALS IMMUNMODULATOREN . 73 5.2.2 ZYTOKINE STABILISIEREN DIE IDIOTYP-SCFV . 76 5.2.3 MOLEKULARE ADJUVANTIEN . 77 5.3 UNTERSUCHUNG DES OPTIMALEN VAKZINIERUNGSWEGES . 78 5.4 TIERMODELL . 79 5.5 UNTERSUCHUNG DER IMMUNANTWORT . 79 5.5.1 HUMORALE IMMUNANTWORT . 79 5.5.2 ZELLULAERE IMMUNANTWORT . 80 5.5.3 KEIN PROTEKTIVER EFFEKT IM ERSTEN TIERVERSUCH . 81 5.5.4 ANDERE MODERNE VAKZINIERUNGS-STRATEGIEN . 82 5.6 KLINISCHE STUDIEN . 83 5.7 PERSPEKTIVEN . 84 6 ZUSAMMENFASSUNG 85 7 LITERATURVERZEICHNIS 86 8 ANHANG 103 8.1 VERWENDETE OLIGONUKLEOTIDE . 103 8.2 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS . 108 8.3 LEBENSLAUF . 112 8.4 SCHRIFTENVERZEICHNIS: . 113
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