Röntgenographische und spektroskopische Charakterisierung der lichtgetriebenen Ionenpumpe Halorhodopsin aus Halobacterium salinarum:
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1 INHALTSANGABE
I
1. ZUSAMMENFASSUNG.4
2. ZIELSETZUNG.7
3. EINLEITUNG.8
3.1. VORKOMMEN UND FUNKTION VON RETINALPROTEINEN.8
3.2. LICHTGETRIEBENE ARCHAEALE IONENPUMPEN.12
3.3. EIGENSCHAFTEN HALOPHILERORGANISMEN.18
3.4. SPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG VON PROTEINEN.21
3.4.1. ROENTGENSTRUKTURANALYSE
.21
3.4.1.1. BEUGUNG VON ROENTGENSTRAHLUNG AN KRISTALLEN.21
3.4.1.2. BERECHNUNG DER ELEKTRONENDICHTE.24
3.4.1.3. LOESUNG DES PHASENPROBLEMS.25
3.4.2. FT-IR- UND -RAMAN-SPEKTROSKOPIE.27
3.5. ANREICHERUNG VON PHOTOZYKLUSINTERMEDIATEN.29
4. ERGEBNISSE.33
4.1. EINFUEHRUNG.33
4.1.1. STRUKTURUNTERSUCHUNGEN AN HR.33
4.1.2. HR-TIEFTEMPERATURINTERMEDIATE
.36
4.2. PROTEINREINIGUNG.36
4.3. KRISTALLISATION DES HALORHODOPSIN WILDTYPS SOWIE EINIGER
MUTANTEN.37
4.4. ROENTGENSTRUKTURANALYSEN.41
4.4.1. DATENSAMMLUNG
.41
4.4.2. MOLEKULARER ERSATZ (MOLECULAR REPLACEMENT), MODELLBAU UND
VERFEINERUNG. 42
4.5. STRUKTUR DES AUSGANGSZUSTANDES (HR578). 43
4.5.1. DIE KRISTALLPACKUNG
.43
4.5.2. DER AUFTRAU DES HR-TRIMERS
.44
4.5.3. DIE CHLORIDBINDUNGSSTELLE
.46
4.6. LAUE DIFFRAKTION.49
4.7. STATISCHE UV/VIS-SPEKTROSKOPIE AN KRISTALLEN.51
4.7.1. DAS K-INTERMEDIAT
.51
4.7.2. DAS L-INTERMEDIAT
.56
4.8. FT-IR- UND -RAMAN-SPEKTROSKOPIE AN KRISTALLEN.58
VERGLEICH VON KRISTALL- UND SUSPENSIONSSPEKTREN.58
4.8.2. BESTIMMUNG DES ISOMERENVERHAELTNISSES IN HR-KRISTALLEN.62
4.8.3. TEMPERATURSTUDIE DES L/LJI-UEBERGANGS IN HR-KRISTALLEN
.65
4.9. MALDI-TOF
SPEKTROSKOPIE AN
HR-
UND
BR-ISOLATEN.69
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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1 INHALTSANGABE
II
5. DISKUSSION.73
5.1. THEORIE DER KRISTALLISATION VON MEMBRANPROTEINEN IN MESOPHASEN.73
5.2. VERGLEICH DER TERTIAERSTRUKTUREN VON HR UND BR.79
5.3. DIE RETINALBINDUNGSTASCHE.80
5.4. DIE QUARTAERSTRUKTUREN VON HR UND BR.84
5.5. KONSERVIERTE AMINOSAEUREN ARCHAEALER RETINALPROTEINE.86
5.6. DIE CHLORIDBINDUNGSSTELLE.91
5.6.1. SELEKTIVITAET VERSUS SPEZIFITAET
.94
5.6.2. DER PALMITINSAEURE-PROTEIN-KOMPLEX
.95
5.7. TRANSPORTMODELL DER ARCHAEALEN IONENPUMPEN HR UND BR.96
5.8. PUTATIVE CHLORID-AUFNAHME UND -ABGABE.102
5.9. MOEGLICHER TRANSPORTWEG DES SUBSTRATES DURCH HR.104
5.10. SPEKTROSKOPISCHE ANALYSE VON PHOTOZYKLUSINTERMDIATEN.106
5.10.1. UV/VIS-SPEKTROSKOPIE
.106
5.10.2. FT-IR UND-RAMAN SPEKTROSKOPIE AN HR-KRISTALLEN
.108
5.10.3. KONFORMATIONSAENDERUNGEN IM HR-KRISTALL
.110
6. AUSBLICK.113
7. MATERIAL UND METHODEN.114
7.1. MATERIAL.114
7.1.1. REAGENTIEN UND ENZYME
.114
7.1.2. SONSTIGE MATERIALIEN
.114
7.1.3. STAEMME
.7/5
7.1.4. NAEHRMEDIEN
.7/5
7.1.5. PUFFER UND LOESUNGEN
.116
7.2. MIKROBIOLOGISCHE METHODEN.119
7.3. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.119
7.3.1. HR-ISOLIERUNG
.719
7.3.2. HR-KRISTALLISATION
.720
7.3.3. MECHANISCHE ISOLIERUNG VON HR-KRISTALLEN AUS LIPIDPHASEN
.72/
7.3.4. ISOLIERUNG VON HR-KRISTALLEN MITTELS LIPASEVERDAU
.122
7.3.5. BR-ISOLIERUNG
.722
7.3.6. BR-WILDTYP
.722
7.3.7. BR-KRISTALLISATION NACH "KLASSISCHEN"METHODEN
.123
7.3.7.1. PRIMAERSOLUBILISIERUNG.123
13
.
1
.
2
.
DETERGENZWECHSEL.124
13
.
13
.
KRISTALLISATIONSVERSUCHE.124
7.3.8. BR-KRISTALLISATION IN ARTIFIZIELLEN MEMBRANSYSTEMEN.725
1 INHALTSANGABE
III
7.3.8.1. SOLUBILISIERUNG.125
7.3.8.2. REINIGUNG.125
7.3.8.3. KRISTALLISATIONSVERSUCHE.126
7.3.9. ISOLIERUNG ARCHAEALER LIPIDFRAKTIONEN
.126
7.3.10. HERSTELLUNG UND ISOLIERUNG ISOTOPENMARKIERTEN BR'S
.127
7.3.10.1. HERSTELLUNG ISOTOPENMARKIERTEN ALGENMEDIUMS.127
7.3.10.2. HERSTELLUNG ISOTOPENMARKIERTEN ALGENMEDIUMS.128
7.3.10.3. PROBENPRAEPARATION FUER DIE NMR-SPEKTOSKOPIE.129
7.3.11. SPEKTROSKOPISCHE METHODEN
.130
7.3.11.1. UV/VIS-SPEKTROSKOPIE.130
7.3.11.2. FTIR-SPEKTROSKOPIE.131
7.3.11.3. PROTEINKRISTALLOGRAPHISCHE METHODEN.131
7.3.11.3.1. DATENSAMMLUNG.131
7.3.11.3.2. DATEN-INDIZIERUNG, -INTEGRATION UND DATENREDUKTION.132
7.3.11.3.3. MOLEKULARER ERSATZ.132
7.3.11.3.4. LAUE DIFFRAKTIONSSTUDIEN.132
7.3.11.3.5. GRAPHISCHE DARSTELLUNGEN.132
8. ABKUERZUNGEN UND SYMBOLE.133
9. ANHANG.135
9.1.
ZUSAMMENFASSUNG DER FT-IR UND MIKRO-RESONANZ-RAMAN DATEN.135
9.1.1. RESONANZ-RAMAN SCHWINGUNGSBANDEN AM KRISTALL BEI 568 NM
.135
9.1.2. LISTE DER GESAMMELTEN DATENSAETZE AN HR-KRISTALLEN
.136
10. DANKSAGUNG.139
11. LEBENSLAUF.140
12. ABBILDUNGSVERZEICHNIS 142
13. LITERATURVERZEICHNIS.
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