Expressionsanalyse apoptoserelevanter Gene aus der Bcl-2-Familie in humanen Gliomen mittels quantitativer RT-PCR:
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
1.1. GLIOME 1
1.2. APOPTOSE 2
1.2.1. ALLGEMEINE EINFUEHRUNG 2
1.2.2. BCL-2-FAMILIE 3
1.2.3. VORKOMMEN VON BCL-2 7
YY 1.2.4. BRAIN RELATED APOPTOSIS GENE-1 (BRAG-1) 8
1.3. GLYZERINALDEHYD-3-PHOSPHAT-DEHYDROGENASE (GAPDH) 9
1.4. EXPRESSIONSANALYSE 9
1.4.1. ALLGEMEINE METHODEN 9
1.4.2. QUANTITATIVE RT-PCR 10
1.5. AUFGABENSTELLUNG 15
2.
MATERIAL UND METHODEN
2.1. MATERIAL
17
2.1.1. CHEMIKALIEN 17
2.1.2. ENZYME 18
2.1.3. KITS 18
2.1.4. VEKTOREN 19
2.1.5. BAKTERIENSTAEMME 19
2.1.6. DNA-GROESSENSTANDARDS 19
2.1.7. PRIMER 20
2.1.8. MEDIEN, PUFFER UND LOESUNGEN 22
2.1.8.1. DEPC-WASSER 22
2.1.8.2. LOESUNGEN FUER ALLGEMEINE RNA- UND DNA-TECHNIKEN 22
2.1.8.3. MEDIEN UND LOESUNGEN FUER ARBEITEN MIT
E. COLI-ZELLEN 23
UND TUMORGEWEBE
2.1.9. TUMOREN 24
III
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.2. METHODEN 26
2.2.1. ALLGEMEINE NUKLEINSAEURETECHNIKEN 26
2.2.1.1. PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 26
2.2.1.2. FAELLUNG VON NUKLEINSAEUREN 26
2.2.1.3. KONZENTRATIONSBESTIMMUNG 26
2.2.2. RNA-TECHNIKEN 27
2.2.2.1. RNA-ISOLIERUNG 27
2.2.2.2. RNA-AGAROSEGELELEKTROPHORESE 28
2.2.2.3. RNA-SYNTHESE DURCH
IN VZTRO-TRANSKRIPTION 28
2.2.2.4. ERSTSTRANG-CDNA-SYNTHESE 30
. 2.2.3. DNA-TECHNIKEN 31
2.2.3.1. POLYMERASE-KETTENREAKTION - 31
2.2.3.2. QUANTITATIVE RT-PCR 32
2.2.3.3. AGAROSEGELELEKTROPHORESE 33
2.2.3.4. REINIGUNG DER DNA 35
2.2.3.5. LIGATION DER DNA-FRAGMENTE 35
2.2.3.6. PRAEPARATION UND TRANSFORMATION ELEKTROKOMPETENTER
E. COLI-ZEUEN 36
2.2.3.7. HITZESCHOCKTRANSFORMATION CHEMISCH-KOMPETENTER
E. COLI-ZELLEN 36
2.2.3.8. IDENTIFIZIERUNG REKOMBINANTER PLASMIDE IN TRANSFORMIERTEN
E. COLI-
ZELLEN 37
2.2.3.9. PLASMIDPRAEPARATION 37
2.2.3.10. RESTRIKTIORISVERDAU 37
2.2.3.11. DNA-SEQUENZIERUNG 38
3. ERGEBNISSE
3.1.
BRAG-1 - EIN KLONIERUNGSARTEFAKT 39
3.2. EXPRESSIONSANALYSEN DER AUSGEWAEHLTEN GENE DER BCL-2-FAMILIE 43
3.2.1. RNA-ISOLIERUNG 43
3.2.2. ERSTSTRANG-CDNA-SYNTHESE 44
3.2.3. PCR 45
3.2.3.1. PRIMERDESIGN ZUR WILDTYP- UND KOMPETITOR-DNA-KLONIERUNG 45
3.2.3.2. INTRONUEBERSPANNENDE PRIMER 47
IV
3.2.3.3. PCR 49
3.2.4. LIGATION 50
3.2.5. TRANSFORMATION UND PLASMIDPRAEPARATION 52
3.2.6. SEQUENZIERUNG 53
3.2.7.
IN VITRO-TRANSKRIPTION 54
3.2.8. OPTIMIERUNG UND EICHUNG DER QUANTITATIVEN RT-PCR 56
3.2.8.1. OPTIMIERUNG 56
3.2.8.2. EICHUNG 56
3.2.8.3. DURCHGEFUEHRTE KONTROLLEXPERIMENTE 63
3.2.9. ABLAUF DER MESSUNG 65
. 3.2.10. ERGEBNISSE DER MRNA-QUANTIFIZIERUNGEN 68
3.2.10.1. GAPDH 68
3.2.10.2. BCL-2-FAMILIE 73
4. DISKUSSION
4.1. GAPDH 81
4.2. BCL-2 UND BAX 83
4.2.1. EINZELBESTIMMUNG DER MRNA-KONZENTRATIONEN VON BCL-2 UND BAX 83
4.2.2. BCL-2/BAX-VERHAELTNIS 83
4.2.3. INTERPRETATION 84
4.3. BCL-X 87
4.4. METHODIK UND KONTROLLEN , 88
5. AUSBLICK
90
6. ZUSAMMENFASSUNG
92
7. LITERATURVERZEICHNIS
95
ANHANG 108
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