Reduktion des Mobilisierungsrisikos lentiviraler Vektoren durch tRNAs:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG.!
2
EINLEITUNG.
2
2.1
DIE
REVERSE
TRANSKRIPTION
BEI
RETROVIREN
.
2
2.2 GENTHERAPIE
MITTELS
LENTIVIRALERVEKTOREN
.
6
2.3
ZIELDER
ARBEIT:
.
9
3
MATERIAL
.
.
10
3.1
ZELLLINIEN
UND
BAKTERIENSTAEMME
.
10
3.1.1
ZELLLINIEN
.
10
3.1.2
BAKTERIENSTAEMME:
.
10
3.2
NUKLEINSAEUREN
.
11
3.2.1
PLASMIDE
.
11
3.2.2
OLIGONUKLEOTIDE
.
14
3.2.3
WEITERENUKLEINSAEUREN
.
14
3.3
ENZYME
.
14
3.3.1
RESTRIKTIONSENDONUKLASEN.
14
3.3.2
SONSTIGEENZYME
.
15
3.4
REAGENZSYSTEME
.
15
3.5
REAGENZIEN
.
16
3.6
MEDIEN,
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
17
3.6.1
MEDIEN
FILR
BAKTERIENKULTUR
.
17
3.6.2
MEDIEN
UND
PUFFER
FUER
DIE
ZELLKULTUR
.
17
3.6.3
TRANSFEKTIONSREAGENZIEN
.
18
3.7
MOLEKULARBIOLOGISCHE
STANDARDLOESUNGEN
.
18
3.7.1
LOESUNGEN
FUER
GEL-ELEKTROPHORESE
.
18
3.7.2
REAGENZIEN
ZUM
SS-GALAKTOSIDASENACHWEIS.
18
3.8
TECHNISCHEAUSSTATTUNG
.
19
4
METHODEN_
.20
4.1
GENTECHNISCHE
METHODEN
.
20
4.1.1
PRAEPARATIVE
ISOLIERUNG
VON
PLASMID-DNA
AUS
BAKTERIEN
.
20
4.1.2
ISOLIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELEN
.
20
4.1.3
DNA-SEQUENZIERUNG
.
20
4.1.4
POLYMERASE-KETTENREAKTION(PCR)
.
21
4.1.5
KLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
.
22
4.1.6
BAKTERIENKULTIVIERUNG
UND
TRANSFORMATION
.
22
4.1.7
KLONIERUNG
VON
PCR-PRODUKTEN
UEBER
LIMITIERTE
EXONUKLEASE-III-ABSPALTUNG
.
22
4.1.8
ISOLIERUNG
VON
GENOMISCHER
DNA
AUS
TRANSDUZIERTEN
ZELLEN
.
23
4.2
ZELLKULTURVERFAHREN
.
23
4.2.1
KULTIVIERUNG
ADHAERENTER
ZELLEN
.
23
4.2.2
AUSSCHLUSS
VON
MYKOPLASMENKONTAMINATIONEN
.
23
4.2.3
SELEKTION
MIT
BLASTICIDIN
.
24
4.2.4
UEBERPRUEFUNG
DER
GFP-POSITIVEN
ZELLEN
IM
DUCHFLUSSZYTOMETER
.
24
4.2.5
ETABLIERUNG
VON
TRANSDUZIERTENZELUINIEN
.
24
4.2.6
SORTIERUNG
VON
GFP-POSITIVEN
ZELLEN
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
FACS-CALIBURYY.
25
4.2.7
SORTIERUNG
VON
GFP-POSITIVEN
ZELLEN
IM
DURCHFLUSSZYTOMETER
FACS-VANTAGEYY25
4.3
VEKTOR-UNDVIRUSHERSTELLUNG
.
25
4.3.1
CALCIUMPHOSPHAT-TRANSFEKTION
VON
293T-ZELLEN
.
25
4.3.2
VEKTORPRAEPARATION
.
26
4.3.3
INFEKTION
VON
ZELLEN
.
26
4.3.4
TITERBESTIMMUNG
UEBER
GFP-EXPRESSION
4.3.5
TITERBESTIMMUNG
UEBER
SS-GALAKTOSIDASE-EXPRESSION
4.3.6
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DES
SEAP-REPORTERGENS
.
4.4
IMMUNOLOGISCHEMETHODEN
.
4.4.1
ELISA
GEGEN
HIV-CAPSID-ANTIGEN
.
5.1
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
REPLIKATIONSINITIATION
VON
SIV
.
5.1.1
REPLIKATIONSINITIATION
DES
AFFENIMMUNDEFIZIENZVIRUS
(SIV)
.
5.1.2
AUFBAU
VON
SIV-VEKTORKONSTRUKTEN
MIT
MUTIERTER
PBS
.
5.1.3
AUFBAU
ARTIFIZIELLER
TRNA-MOLEKUELE
.
5.1.4
KOMPLEMENTATION
VON
SIV-VEKTOREN
MIT
MUTIERTER
PBS
.
5.1.5
EINFLUSS
DES
AUFBAUS
ARTIFIZIELLER
TRNA-MOLEKUELE
AUF
DIE
KOMPLEMENTATION
5.1.6
EINFLUSS
DER
KONZENTRATION
ARTIFIZIELLER
TRNA-MOLEKUELE
AUF
DIE
VEKTORTRANSDUKTION
.
26
27
27
28
28
29
29
29
29
30
32
34
35
5.2
KOMPLEMENTIERBARE
SIV-VEKTOREN
FUER
DIE
GENTHERAPIE
.
36
5.2.1
MOBILISIERUNG
VON
SIV-VEKTOREN
.
36
5.2.2
ENTWICKLUNG
EINES
4-PLASMID-VEKTORVERPACKUNGSSYSTEMS.
37
5.2.3
HERSTELLUNG
DES
VEKTORKONSTRUKTES
VGABH-X2SIN.
40
5.2.4
HERSTELLUNG
VON
TRANSDUZIERTEN,
LENTIVIRAL
INFIZIERBAREN
ZELLLINIEN
DURCH
ZELLSORTIERUNG.
40
5.2.5
VEKTOR-MOBILISIERUNG
DURCH
HIV-1
UNDSIV
.
41
5.2.6
HERSTELLUNG
FILR
DIE
TRANSFEKTION
GEEIGNETER,
TRANSDUZIERTER
ZELLLINIEN
.
43
5.2.7
MOBILISIERUNG
DURCH
TRANSFEKTION
MIT
VERPACKUNGSPLASMIDEN
.
45
5.2.8
MOBILISIERUNG
EINES
KOMPLEMENTIERBAREN
SIV-VEKTORS
NACH
TRANSFEKTION
MIT
ENV
DELETIONSMUTANTEN
VON
SIV
UND
HLV
1
.
48
5.2.9
SEQUENZANALYSE
DER
VEKTOR-PBS
IN
TRANSDUZIERTEN
ZELLEN
.
49
5.3
KONSTRUKTION
EINES
KOMPLEMENTIERBAREN
VEKTORS
MIT
DER
PBS
VON
HIV-1
.
51
6
DISKUSSION
.
7
LITERATURVERZEICHNIS.
8
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS.
68
DANKSAGUNG
.
69
DISSERTATIONSBEZOGENE
BIBLIOGRAPHISCHEDATEN.
70
LEBENSLAUF
.
71
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| title_full | Reduktion des Mobilisierungsrisikos lentiviraler Vektoren durch tRNAs vorgelegt von Thomas Grunwald |
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