Etablierung und Charakterisierung von monoklonalen Antikörpern gegen ein neues Membranmolekül als Zielprotein für immunmodulatorische Therapieansätze:
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2002
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ETABLIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON
MONOKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN EIN NEUES MEMBRANMOLEKUEL ALS ZIELPROTEIN
FUER IMMUNMODULATORISCHE THERAPIEANSAETZE
DISSERTATION
ZUR ERLANGUNG DES AKADEMISCHEN GRADES
DOCTOR RERUM NATURALIUM
(DR. RER. NAT.)
IM FACH PHARMAZIE
EINGEREICHT AN DER
MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET I
DER HUMBOLDT-UNIVERSITAET ZU BERLIN
VON
APOTHEKERIN ANGELIKA SCHWEIZER
GEBOREN AM 13. JUNI 1973 IN STUTTGART
PRAESIDENT DER HUMBOLDT-UNIVERSITAET ZU BERLIN
PROF. DR. JUERGEN MLYNEK
DEKAN DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN FAKULTAET I
PROF. DR. MICHAEL LINSCHEID
GUTACHTER: 1. PROF. DR. HANS-HUBERT BORDIERT
2. PROF. DR. HANS-DIETER VOLK
3. PROF. DR. MATTHIAS F. MELZIG
TAG DER MUENDLICHEN PRUEFUNG: 28.OKTOBER 2002
IMAGE 2
0 VERZEICHNISSE 6
0.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS 6
1 EINLEITUNG 8
1.1 BEDEUTUNG DER T-ZELLEN IM PROZESS DER TRANSPLANTATABSTORUNG 10
1.1.1 CD4*- UND CDS*-T-ZELLEN 10
1.1.2 DIE T-ZELLAKTIVIERUNG 12
1.1.2.1 INTERAKTION VON T-ZELLREZEPTOR UND MHC-PROTEINEN -SIGNAL 1 DER
T-ZELLAKTIVIERUNG 12
1.1.2.2 WECHSELWIRKUNG COSTIMULATORISCHER MOLEKUELE - SIGNAL 2 DER
T-ZELLAKTIVIERUNG 13
1.1.3 T-ZELL-ANERGIE 14
1.1.4 ALLOANTIGENERKENNUNG DURCH T-ZELLEN 14
1.2 ANTIKOERPER IN DER IMMUNSUPPRESSIVEN THERAPIE 15
1.2.1 ERSTE THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN VON ANTIKOERPERN 15
1.2.2 STRUKTUR EINES IGG ANTIKOERPERMOLEKUELS 16
1.2.3 HERSTELLUNG VON MONOKLONALEN ANTIKOERPERN (MAK) 17
1.2.4 MONOKLONALE ANTIKOERPER IN THERAPIE UND DIAGNOSTIK 19
1.3 T I R C7 ALS POTENTIELLES ZLELANTIGEN FUER NEUE IMMUNMODULATORISCHE
THERAPIEANSAETZE 22
1.3.1 TIRC7 (TCELL IMMUNE RESPONSE CDNA 7) 22
1.3.2 POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN TIRC7 23
1.3.2.1 POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN TIRC7 INHIBIEREN DIE PROLIFERATION
ALLOGEN STIMULIERTER
PBMC UND UNTERDRUECKEN SELEKTIV DIE T H1-SPEZIFISCHE CYTOKINEXPRESSION IN
VITRO 24
1.3.2.2 POLYKLONALE ANTIKOERPER GEGEN TIRC7 VERLAENGERN
SIQMHFIAPTBISHJBERLEBENSRATE
NIERENTRANSPLANTIERTER RATTEN IN VIVO VNS^RRLAER^S^ 24 1.4
AUFGABENSTELLUNG J&!AE^SJFX& 24
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 GERAETELISTE
2.2 REAGENZIEN, KITS UND VERBRAUCHSMATERIALIEN ^F^FFZ..^..^, 25
2.3 VERWENDETE ZELLLINIEN :. .). 28
2.4 ZUR IMMUNISIERUNG VERWENDETE PEPTIDE 28
T 2.5 METHODEN ZUR ETABLIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER (MAK) 29
2.5.1 IMMUNISIERUNGSSCHEMA 29
2.5.2 MYCOPLASMENTEST 30
2.5.3 ZELLFUSION 30
2.5.4 SCREENING DERHYBRIDOME (HYBRIDOMA-ELISA) 32
2.5.5 KLONIERUNG DER HYBRIDOME 33
2.5.6 KRYOKONSERVIERUNG UND AUFTAUEN VON HYBRIDOMEN 33
2.5.7 PRODUKTION UND REINIGUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 34
2.5.8 ISOTYPENCHARAKTERISIERUNG 34
2.5.9 QUANTITATIVE IGG-BESTIMMUNG 34
2
IMAGE 3
2.6 METHODEN ZUR CHARAKTERISIERUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 35
2.6.1 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG 35
2.6.1.1 GEWINNUNG PERIPHERER MONONUKLEARER ZELLEN (PBMC) 35
2.6.1.2 ELISA AUF PERIPHEREN MONONUKLEAEREN ZELLEN (PBMC) 36
2.6.1.3 IMMUNFLUORESZENZTEST 37
2.6.2 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG 38
2.6.2.1 KULTUR UND STIMULATIONSBEDINGUNGEN: 38
2.6.2.1.1 KOKULTURVON HUMANEN PBMC MIT MONOKLONALEN ANTIKOERPERN 38
2.6.2.1.2 KOKULTUR VON HUMANEN PBMC MIT PEPTIDBLOCKIERTEN MONOKLONALEN
ANTIKOERPERN 38
2.6.2.1.3 KOKULTURVON HUMANEN PBMC MIT MONOKLONALEN ANTIKOERPERN IN
KOMBINATION MIT
CYCLOSPORINA, RAPAMYCIN UND FK506 39
2.6.2.1.4 KOKULTURVON HUMANEN PBMC MIT FRAGMENTEN MONOKLONALER
ANTIKOERPER 39
2.6.2.2 PROLIFERATIONSTEST 41
2.6.2.2.1 3 H - T H Y M I D I N - E I N B AU 41
2.6.2.2.2 BRDU-EINBAU 41
2.6.2.3 PROLIFERATIONSTESTS MIT T-ZELLSUBSETS 42
2.6.2.4 CYTOKINBESTIMMUNG MITTELS ELISA 43
2.7 QUANTITATIVE UND STATISTISCHE AUSWERTUNG 45
2.7.1 QUANTITATIVE AUSWERTUNG DURCH EINFACHE LINEARE REGRESSION 45
2.7.2 BERECHNUNG UND DARSTELLUNG VON MITTELWERTEN UND
STANDARDABWEICHUNGEN 45
2. 7.3 BERECHNUNG DER ID M (HEMMDOSIS AUF 50% IM VERGLEICH ZUR
ENTSPRECHEND EINGESETZTEN
KONTROLLE) *..:.: 46
2.7.4 STATISTISCHE PRUEFUNG VON MITTELWERTEN UNTER EINSATZ DES T-TEST 46
3 ERGEBNISSE 48
3.1 ETABLIERUNG UND SELEKTION SPEZIFISCHER MONOKLONALER ANTIKOERPER 48
3.1.1 IMMUNISIERUNGEN UND FUSIONEN 48
3.1.2 ETABLIERUNG DER HYBRIDOME 48
3.1.3 SELEKTION DER HYBRIDOME 49
3.1.3.1 ISOTYPENBESTIMMUNG 49
3.13.2 WACHSTUMS- UND PRODUKTIONSEIGENSCHAFTEN DER IGG-PRODUZIERENDEN
HYBRIDOME 50
3.1.3.3 REINIGUNG DER MONOKLONALEN ANTIKOERPER 50
3.1.3.4 BIOCHEMISCHE UND FUNKTIONELLE ANALYSE DER MAK 50
3.2 BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER SELEKTIERTEN MONOKLONALEN
ANTIKOERPER (MAK) 52
3.2.1 PEPTID-EUSA 52
3.2.2 PBMC-ELISA 55
3.2.3 IMMUNFLUORESZENZTEST 57
IMAGE 4
3.3 FUNKTIONELLE CHARAKTERISIERUNG DER ETABLIERTEN MONOKLONALEN
ANTIKOERPER 59
3.3.1 PROLIFERATIONSTEST 59
3.3.1.1 OPTIMIERUNG DES PROTOKOLLS FUER DEN EINSATZ MONOKLONALER
ANTIKOERPER
IM PROLIFERATIONSTEST 60
3.3.1.2 ERGEBNISSE DER PROLIFERATIONSTESTS MIT 3H-THYMIDINEINBAU 61
3.3.1.3 ERGEBNISSE DER PROLIFERATIONSTESTS MIT BRDU-EINBAU 62
3.3.1.4 PROLIFERATIONSTEST NACH BLOCKADE DER ANTIGENBINDENDEN
ANTIKOERPERREGIONEN 64
3.3.1.5 PROLIFERATIONSTEST MIT ANTIKOERPERFRAGMENTEN 66
3.3.1.6 PROLIFERATIONSTESTS MIT FRAGMENTEN MONOKLONALER TIRC7-ANTIKOERPER
67
3.3.1.7 PROLIFERATIONSTEST IN KOMBINATION MIT IMMUNSUPPRESSIVA 69
3.3.1.7.1 CYCLOSPORIN A (CYA) 70
3.3.1.7.2 TACROLIMUS (FK506) 73
3.3.1.7.3 SIROLIMUS (RAPAMYCIN) 76
3.3.1.8 T-ZELL-SUBSETS IM PROLIFERATIONSTEST 79
3.3.2 CYTOKINBESTIMMUNG 82
3.3.2.1 INTERFERON-? (IFNY) 82
3.3.2.2 LNTERLEUKIN-2 (IL-2) 84
3.3.2.3 TUMOR-NEKROSE-FAKTOR A (TNFA) 86
3.3.2.4 LNTERLEUKIN-1SS(IL-1SS) 88
3.3.2.5 LNTERLEUKIN-12 (IL-12) 89
3.3.2.6 LNTERLEUKIN-4 (IL-4) 90
3.3.2.7 LNTERLEUKIN-6 (IL-6) 92
3.3.2.8 LNTERLEUKIN-10(IL-10) 93
3.3.2.9 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE DER CYTOKINBESTIMMUNGEN 96
4 DISKUSSION 97
4.1 PROTEINERKENNUNG MONOKLONALER TIRC7-ANTIKOERPER 97
4.2 INHIBIERUNG DER PROLIFERATIONSRATE MITOGEN STIMULIERTER PBMC DURCH T
I R C 7 M AK 98
4.3 ANGRIFFSPUNKTE EINER SPEZIFISCHEN, IMMUNMODULATORISCHEN THERAPIE 99
4.3.1 T-ZELLSUBSETS 99
4.3.2 COSTIMULATORISCHE MOLEKUELE 102
4G.3 CYTOKINE 104
4.4 T I R C 7 M AK IN KOMBINATION MIT XENOBIOTISCHEN IMMUNSUPPRESSIVA
109
4.5 AUSBLICK 111
5 ZUSAMMENFASSUNG 112
6 SUMMARY 114
IMAGE 5
7 LITERATURVERZEICHNIS 116
8 ERKLAERUNG 132
9 DANKSAGUNG 133
10 LEBENSLAUF 134
11 ANHANG 135
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