Molekulare und funktionelle Analyse der p21-aktivierten Kinase Mbt (mushroom bodies tiny) in der Augen- und Pilzkörperentwicklung von Drosophila melanogaster:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG
.1
1.1 DIE FAMILIE DER P21-AKTIVIERTEN KINASEN
. 2
1.1.1 STRUKTURMERKMALE VON PAK-PROTEINEN.2
1.1.2 FUNKTION VON PAK-PROTEINEN.3
1.1.3 P21- AKTIVIERTE KINASEN IN DROSOPHILA.5
1.2 PER JWFA-PHAENOTVP
. 5
1.3 ZIEL DER ARBEIT
_._._6
2. MATERIALIEN
.8
2.1 CHEMIKALIEN
._._._._._._.
8
2.2 ENZYME UND REAGENZIEN
--._._._._8
2.3 MEDIEN
_._._._._._.
8
2.4 KITS
_8
2.5 VEKTOREN
. 8
2.6 PUFFER
. 9
2.7 PROTEASEINHIBITOREN
.10
2.8 ANTIKOERPER
.10
2.8.1 PRIMAERE ANTIKOERPER
.10
2.8.2 SEKUNDAERE ANTIKOERPER.11
2.9 FLIEGENSTAEMME
_.11
2.10 SOFTWARE
._._.13
2.11 ZELLLINIEN
_ 13
2.12 KONSTRUKTE_ 14
3. METHODEN
.15
3.1 PRAEPARATION VON PIASMID-DNS
_. 15
3.2 PRAEPARATION VON PLASMID-DNS AUS HEFE
_._._15
3.3 PRAEPARATION VON GENOMISCHER DNS AUS ADULTEN FLIEGEN
._15
3.4 LINKER-PCR
_16
3.5 PCR
16
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/967103428
INHALTSVERZEICHNIS
3.6 EINFAHREN VON PUNKTMUTATIONEN IN PLASMID-DNS
. 16
3.7 SDS-PAGE UND WESTERN BLOT
YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYFT
17
3.8 TRANSFEKTION VON SAEUGERZELLEN
.17
3.9 CO-IMNUINNRARIPITATION ZUM NACHWEIS DER INTERAKTION ZWISCHEN MBT UND
MOEGLICHEN
INTERAKTIONSPARTNERN
.-.
17
3.10
IN VITRO
KINASE-ASSAV.-.
18
3.11 PHOSPHATASE ASSAV
-.- -.-. 18
3.12 AUFREINIGUNE EINES GST-FUSIONSPROTEINS
.-.-. 18
3.13 PNLLDOWN ASSAV
.-.19
3.14 ISOLATION VON YYINCLUSION BODIES" FUER DIE IMMUNISIERUNG
. 19
3.15 IMMUNFLUORESZENSFSRBUNG VON LARVALEN UND PUPALEN AUGENSCHEIBEN
-.-20
3.16 SEMIDONNSCHNITTE VON AUGEN ADULTER FLIEGEN
.-.-.-- 20
3.17 MOSAIK ANALYSE MIT EINEM REORESSIBLE ZELLMARKER (MARCM)
.-. 21
3.18 PARAFFINSCHNITTE VON ADULTEN KOEPFEN
-.-.-.- 22
3.19 VOLUMENBESTIMMUNG AUF PAR AFFIN SCHNITTEN: PLANIMETRIE
.-.-. 22
3.20 FAERBUNGEN VON AIIGENSCHEIBEN MIT ACRIDINORANGE (NACH SPREII ET AL.
1971)
-22
3.21 KEIMBAHNTRANSFORMATION VON FLIEGEN
.22
3.22 REMOHILISATION EINES P-ELEMENTS AUF DEM DRITTEN CHROMOSOM
-.-23
4. ERGEBNISSE
.!.24
4.1 DER #W6F-PHAENOTVP
.-.-.-.
24
4.1.1 LOKALISIERUNG VON MBT AN DEN ADHAERENZVERBINDUNGEN IN SICH
ENTWICKELNDEN
PHOTOREZEPTORZELLEN.24
4.1.2 MBT SPIELT EINE ROLLE IN DER PHOTOREZEPTORZELLMORPHOEENESE.
T
.26
4.1.3 MBT WIRD NICHT FUER DIE REKRUTIERUNG VON PHOTOREZEPTORZELLEN
BENOETIGT, ABER FUER DEREN
UEBERLEBEN
.29
4.1.4 MBT IST FUER DIE KORREKTE AUSBILDUNG DER RHABDOMERE WICHTIG.31
4.2 INTERAKTION VON MBT MIT KLEINEN GTPASEN
. 32
4.2.1 MBT INTERAGIERT MIT AKTIVIERTEM CDC42
.34
43 UNTERSUCHUNGEN ZUR KINASEAKTIVITAET VON MBT
IN VITRO
. 35
4.3.1 BINDUNG VON CDC42 REGULIERT DIE KINASEAKTIVITAET VON MBT
IN VITRO
.35
4.4 TEST DER MBT-KONSTRUKTE
IN VIVO.
_37
4.4.1 DIE. KINASFTRIOMAENE UND DIE CDC42-BINDUNGSDOMAENE SIND FUER DIE
FUNKTION VON MBT
WAEHREND DER AUGENENTWICKLUNG ESSENTIELL.38
INHALTSVERZEICHNIS
4.4.2 CDC42 VERMITTELT DIE LOKALISATION VON MBT AN ADHAERENZVERBINDUNGEN
.39
4.4.3 DIE KINASEAKTIVITAET UND DIE CDC42-BINDUNGSDOMAENE SIND ESSENTIELL
FUER DIE FUNKTION
VON MBT WAEHREND DER PILZKOERPERENTWICKLUNG.43
4.S SUCHE NACH MBT-INTERAKTIONSPARTNERN
.-.-. 48
4.5.1 DER YEAST-TWO-HVBRID SCREEN
.49
4.5.2 DER GENETISCHE SCREEN.54
4.5.3 TEST MOEGLICHER MBT INTERAKTIONSPARTNER.62
4.5.4 HINWEISE AUF EINE BETEILIGUNG VON MBT IM ERK-SIENALWEE.63
5. DISKUSSION
.65
5.1 MBT WIRD DURCH AKTIVIERTES CDC42 REGULIERT
.-.65
5.2 MBT HAT AUCH KINASEUNABHAENGIGE FUNKTIONEN
. 65
53 CDC42 VERMITTELT DIE LOKALISATION VON MBT AN ADHAERENZVERBINDUNGEN
WAHREND DER
MORPHOGENESE DER
PHOTOREZEPTORZELLEN.-.-67
5.4 UNTERSCHIEDE IN DER FUNKTION VON MBT IN AUGEN- UND
PILZKDRPERENTWICKLUNG
. 68
5.5 KANN MBT APOPTOSE REGULIEREN?
.
68
5.6 CG8818 UND CG14880 SIND POTENTIELLE INTERAKTIONSPARTNER UND
PHOSPHORVLIERUNGSSUBSTRATE VON
MBT-.-.
69
5.7 CANOE UND EIP75B SIND GENETISCHE INTERAKTIONSPARTNER VON MBT
.-. 70
5.8 SLINGSHOT UND TWINSTAR BILDEN EINE VERBINDUNG VON MBT ZUM
CVTOSKELETT
.71
5.10 MBT UND CRUMBS SPIELEN EINE ROLLE FUER DIE ADHAERENZVERBINDUNGEN
WAEHREND DER
MORPHOGENESE DER PHOTOREZEPTORZELLEN-.-.---. 72
5.9 MODELL FUER DIE FUNKTION VON MBT WAHREND DER AUGENENTWICKLUNG
-73
5.11 HINWEISE AUF EINE FUNKTION VON MBT IM RAF-MEK-ERK-SIGNALWEG
.-- 74
6. ZUSAMMENFASSUNG
.75
7. SUMMARY
.
+
.77
8. LITERATUR
.79
9. ANHANG
.87
9.1 PRIMER
_87
9.2 SEQUENZEN
-.-.-.-.-.
88
9.2.1 MBT
.88
9.2.2 CDC42.90
9.2.3 RACL.90
9.2.4 RHO 1.91
INHALTSVERZEICHNIS
9.2.5 CG8818
.91
9.2.6 CG14880.92
93
ABKUERZUNGEN-93 |
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