Die Rolle des Tumornekrosefaktor (TNF)-Rezeptor 2 bei der antitumoralen Wirkung von TNF:
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Aachen
Shaker
2002
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| adam_text | INHALTSVERZEICHNIS 7
INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGEN 13
ZUSAMMENFASSUNG 15
SUMMARY 17
1 EINLEITUNG 19
1.1 Tumorentstehung 19
1.1.1 Tumorangiogenese 20
1.2 Tumorimmunität 21
1.2.1 Die Abwehr durch das natürliche Immunsystem 22
1.2.2 Die Abwehr durch das adaptive Immunsystem 23
1.3 Tumortherapien 24
1.4 Das historisch erste antitumoral wirksame Zytokin:
der Tumornekrosefaktor 26
1.4.1 TNF ein pleiotropes Zytokin 26
1.4.2 TNF und Tumornekrose 27
a) Verstärkte Anreicherung im Tumor 28
b)TNF Mutanten mit geringerer Toxizität und/oder
höherer antitumoraler Wirkung 29
c) TNF in Kombination mit Reagenzien, die seine Toxizität
herabsetzen bzw. seine antitumorale Wirkung verstärken 29
1.4.3 Entwicklung der Fragestellung und Zielsetzung dieser Arbeit 31
2 MATERIAL UND METHODEN 33
2.1 Material 33
2.1.1 Chemikalien 33
INHALTSVERZEICHNIS 2.1.2 Reagenzien 33
2.1.3 Enzyme 34
2.1.4 Antikörper 34
2.1.5 Oligonukleotide 34
2.1.6 Plasmide 35
2.1.7 DNA und Protein Marker 35
2.1.8 Medien, Puffer und Lösungen 35
2.1.9 Zellkultur Medien und Zusätze 35
2.1.10 Zelllinien 36
2.1.11 Tiere 36
2.2 Methoden 38
2.2.1 Gelelektrophorese 38
a)DNA 38
b) Protein 39
2.2.2 Isolierung von DNA 3
a) Extraktion genomischer DNA aus Schwanzbiopsien ¦
b)Plasmidpräparation mit Ionenaustauschersäulen 4
c) Isolierung eines ca. 70 kb großen DNA Fragmentes
aus dem Agarosegel d) Ethanolpräzipitation von DNA 2.2.3 Bestimmung der Proteinkonzentration (nach Bradford, 1976) 42
2.2.4 Biotinylierung von 80M2 42
43
2.2.5 Herstellung von Gewebe Lysaten 43
2.2.6 Immunpräzipitation des huTNF R2 2.2.7 Western Blot zur Detektion des huTNF R2 U
2.2.8 Extraktion von Gesamt RNA aus Gewebe ^
2.2.9 RNase Protection Assay, RPA 2.2.10 Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA a) IFNy Konzentration in Überständen von Milzzellen 4
b) HuTNF R2 Konzentration im Plasma 47
INHALTSVERZEICHNIS 9
2.2.11 Zellkultur 48
a) Auftauen von Zellen 48
b) Ernte adhärenter Zellen 48
c) Einfrieren von Zellen 48
d) Bestimmung der Zellzahl lebender Zellen 48
2.2.12Präparation und Kultivierung von Milzzellen
und Thymozyten 49
2.2.13 Bioassays 49
a) TNF vermittelte Zytotoxizität 49
b) Fas vermittelte Zytotoxizität auf RLZ Zellen 50
c) Zytotoxische Effektorfunktionen von Milzzellen 50
d) Thymozyten Proliferation 51
2.2.14 Durchflußzytometrie 51
2.2.15 Tierexperimente 52
2.2.15.1 Genotypisierung von transgenen Tieren mittels Polymerase
Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 52
a)huTNF R2 52
b)Tie2 tmTNF 54
2.2.15.2 Experimente im Tumormodell der Maus 54
a) Subkutane Tumoren und Tumorbehandlung 54
b) i. v. Injektion 55
c) Lungenmetastasenmodell 56
2.2.15.3 Gefrierschnitte und X Gal Färbung 56
2.2.15.4 Perfusion 57
3 ERGEBNISSE 59
3.1 Etablierung von Tumormodellen in huTNF R2
transgenen Tieren 59
3.1.1 huTNF R2 transgene Ratten 59
3.1.1.1 Aufreinigung eines ca. 70 kb großen, den huTNF R2
codierenden, genomischen DNA Fragments 59
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