Der programmierte Zelltod humaner Spermatogenesezellen und ejakulierter Spermatozoen: Mechanismen der Signaltransduktion und assoziierter Membranveränderungen im physiologischen und pathologischen Kontext im Hinblick auf eine potentielle diagnostische und therapeutische Konsequenz
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Aachen
Shaker
2002
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|---|---|
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Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
2 Spezielle Einführung in die Thematik 3
2.1 Apoptose: Der programmierte Zelltod 3
2.1.1 Geschichte der Apoptoseforschung 3
2.1.2 Charakteristika der Apoptose 5
2.1.3 Signaltransduktion und Regulation der Apoptose 10
2.1.4 Methoden zur Bestimmung von Apoptose 31
2.1.5 Erkenntnisse zur Apoptose des Germinalepithels und ejakulierter Spermatozoen 32
2.2 Methoden der Spermatozoenseparation 44
2.2.1 Glaswollfiltration 44
2.2.2 Swim up 45
2.2.3 Dichtegradientenzentnfugation 45
2.2.4 MACS 46
2.3 Datenverarbeitung in der Andrologie 48
2.3.1 Spezielle Probleme der Datenverarbeitung in der Andrologie 50
2.4 Ziele der Arbeit im Detail 52
3 Material und Methoden 53
3.1 Probanden und Patienten 53
3.1.1 Ejakulate 53
3.1.2 Hodenbioptate 53
3.2 Klinische und Laboruntersuchungen 53
3.2.1 Hodenvolumen 53
3.2.2 Hormonuntersuchungen 54
3.3 Ejakulatanalysen 54
3.3.1 Konventionelle Ejakulatananlysen 54
3.3.2 Computergestützte Motilitätsanalyse 55
3.3.3 Determination der Morphologie, Chromatinkondensation und Integrität der DNA
humaner Spermatozoen 60
3.3.4 Nachweis der Akrosomenreaktion 61
3.3.5 Supravitalfärbung 62
3.3.6 Peroxidasefärbung 63
3.4 Ejakulataufbereitung 63
3.5 Kryokonservierung 63
3.5.1 Kryoprotektiva 64
VW _______———
3.5.2 Methode der Abkühlung w
3.5.3 Lagerung kryokonservierten Spermas °3
3.5.4 Methode des Auftauens 65
3.6 Immunotopografie 65
3.6.1 Direkte Immunfluoreszenz
fifi
3.6.2 Zytospinpräparation
PO
3.6.3 Immunhistochemie
3.6.4 Elektronenmikroskopie 69
3.7 Westernblot 70
3.7.1 Herstellung der Proteinlysate 70
3.7.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
3.7.3 Sodiumdodecylsulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese
3.7.4 Proteintransfer
3.7.5 Immunoblot 73
3.7.6 Nachweissysteme gebundener Sekundärantikörper
3.7.7 Wiederverwendung von Membranen
3.7.8 Densitometrische Auswertung der Signale
3.8 Intrazelluläre Fluoreszenzaktivierung 75
3.8.1 Messung aktiver Caspasen 75
3.8.2 Fluoreszenzmikroskopische Auswertung
3.8.3 FACS Analyse 76
3.8.4 Nachweis des mitochondrialen transmembranösen Potentials °
3.9 Zellseparation 78
3.9.1 Dichtegradientenzentrifugation 78
3.9.2 MACS 78
3.10 Datenverarbeitung 80
3.10.1 Entwicklung einer relationaler Datenbank für Andrologen und
Reproduktionsmediziner Winsperm® 80
3.10.2 Kommerzielle Soft und Hardware 81
3.10.3 Bildverarbeitung 81
3.11 Statistik 82
4 Ergebnisse 83
4.1 Charakterisierung von Probanden und Patienten 83
4.1.1 Patienten und Probanden, deren Ejakulate verwendet wurden 83
4.1.2 Gruppe der Patienten die sich einer Hodenbiopsie zur Infertilitätsdiagnostik
unterzogen 89
4.1.3 Zusammenfassung der Charakterisierung von Probanden und Patienten 90
lkK,
«
4.2 Evaluation wichtiger Untersuchungsmethoden 91
4.2.1 Evaluation der computergestützten Motilitätsanalyse 91
4.2.2 Vergleich der Systeme Mika Medical 1.5, Hamilton Thorne IVOS und Mika Medical
2.0 91
4.2.3 Berechnung der CASA Normwerte für das System Mika Medical 2.0 94
4.2.4 Adaptation und Standardisierung des Westernblots ejakulierter Spermatozoen 95
4.2.5 Evaluation der Intrazellulären Fluoreszenzaktivierung 97
4.2.6 Evaluation der Annexin V basierten immunomagnetischen Zellseparation 98
4.2.7 Evaluation des CD45 MACS 100
4.3 Nachweis grundlegender Elemente der Apoptose in humanen ejakulierten
Spermatozoen 101
4.3.1 Annexin V Bindung 101
4.3.2 Rezeptorprotein CD95 103
4.3.3 Pan Caspase 104
4.3.4 Caspasen 8, 9,1 und 3 105
4.3.5 Regulatoren der Apoptose 107
4.3.6 Elemente der nuklearen Degradation 110
4.4 Einfluss von Glycerin auf die Initiation, Regulation und Exekution der
Apoptose im Rahmen der Kryokonservierung 112
4.4.1 Versuchsablauf 112
4.4.2 Ergebnisse 112
4.5 Charakterisierung AN MB* und ANMB Spermatozoensubpopulationen 128
4.5.1 Ultrastruktur der Annexin V MicroBead Bindung 128
4.5.2 Wichtige klassische Spermiogrammvariablen 128
4.5.3 Nachweis von CD95 134
4.5.4 Pan Caspase Aktivität in ejakulierten Spermatozoen von Probanden 136
4.5.5 Pan Caspase Aktivität in ejakulierten Spermatozoen von Patienten mit normalem
oder pathologischem Spermiogramm 139
4.5.6 Detaillierte Untersuchung aktivierter Caspasen in Relation zur Integrität der
Zellmembran 140
4.5.7 Differentielle Untersuchung aktivierter Caspasen in Relation zur Integrität der
Zellmembran an einer Subpopulation reifer und motiler Spermatozoen 153
4.5.8 Mitochondriale Membranpotentialveränderungen 167
4.6 Untersuchungen zum programmierten Zelltod in der Spermatogenese 172
4.6.1 Klassifikation und histologische Beurteilung der Bioptate 172
4.6.2 Tumorscreening der Bioptate 175
4.6.3 Analyse der in Beziehung zur Apoptose stehenden Epitope 175
x | 4.6.4 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen an humanem
Hodengewebe im Detail 188
4.7 Winsperm® 197
5 Diskussion 199
5.1 Probanden und Patienten 199
5.2 Evaluation wichtiger Untersuchungsmethoden 200
5.2.1 Evaluation der computergestützten Motilitätsanalyse 200
5.2.2 Adaptation und Standardisierung des Western Blots ejakulierter Spermatozoen 201
5.2.3 Evaluation der Intrazellulären Fluoreszenzaktivierung und der Messung des
transmembranösen mitochondrialen Potentials 201
5.2.4 Evaluation der Annexin V basierten immunomagnetischen Zellseparation 201
5.2.5 CD45 MACS 202
5.3 Untersuchungen zum Vorhandensein wesentlicher Elemente der Apoptose in
humanen ejakulierten Spermatozoen 203
5.3.1 Externalisation von Phosphatidylserin und Bindung von Annexin V 203
5.3.2 CD95 203
5.3.3 Nachweis der Präsenz und funktionellen Kompetenz von Caspasen in ejakulierten
Spermatozoen 205
5.3.4 Nachweis der Präsenz wichtiger regulatorischer Proteine der Apoptose 206
5.3.5 Elemente der nuklearen Degradation 208
5.4 Einfluss von Glyzerin auf die Initiation, Regulation und Exekution der
Apoptose im Rahmen der Kryokonservierung 209
5.4.1 Rezeptorprotein CD95 209
5.4.2 Caspasen 8, 9, 1 und 3 210
5.4.3 Regulatoren der Apoptose 211
5.4.4 Elemente der nuklearen Degradation 212
55 « ! *nnexin y ¦ B ndung am Spermatozoon: Evaluation einer neuen
seiektionsmethode und Charakterisierung der gewonnenen
Spermatozoensubpopulationen 213
5.5.1 Quantifizierung der Annexin V Bindungsfähigkeit 213
5.5.2 Ultrastruktur der Annexin V MicroBead Bindung 214
5.5.3 Motilitätsanalysen (CASA) 215
5.5.4 Supravitalfärbung 215
5.5.5 Nachweis von CD95 215
5.5.6 Pan Caspase Aktivität via MACS separierter Spermatozoen von Probanden in
Relation zur Kühlgeschwindigkeit 216
5.5.7 Pan Caspase Aktivität in ejakulierten Spermatozoen von Patienten mit normalem
oder pathologischem Spermiogramm 217
Sä*,..»
xj_
5.5.8 Detaillierte Untersuchung aktivierter Caspasen in Relation zur Integrität der
Zellmembran 217
5.5.9 Untersuchung aktivierter Caspasen 8, 9 und 3 in den Subpopulatlonen nach einer
Dichtegradientenzentrlfugation 220
5.5.10 Mitochondriale Membranpotentialveränderungen 222
5.6 Untersuchungen zum programmierten Zelltod in der Spermatogenese 223
5.6.1 Tumorscreening der Bioptate 223
5.6.2 Analyse der in Beziehung zur Apoptose stehenden Epitope 223
5.7 Das relationale Datenbankmodell Winsperm® 2002 227
6 Zusammenfassung und Ausblick 228
6.1 Präsenz und Funktionalität wesentlicher Elemente der Apoptose in humanen
Spermatogenesezellen und ejakulierten Spermatozoen 228
6.2 Einfluss der Kryokonservierung und Dichtegradientenzentrlfugation auf die
Apoptose ejakulierter Spermatozoen 229
6.3 Möglichkeiten und Grenzen der Annexin V basierten Anreicherung nicht
apoptotischer Spermatozoen in Diagnostik und Therapie 231
7 Literaturverzeichnis 233
8 Anhang 276
8.1 Puffer, Lösungen und Chemikalien 276
8.1.1 Puffer und Lösungen 276
8.1.2 Chemikalien 279
8.2 Biologisches Material 281
8.2.1 Proteine, Enzyme, Peptide 281
8.2.2 Antikörper, Antiseren 281
8.2.3 Labortechnik 283
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| spelling | Paasch, Uwe 1965- Verfasser (DE-588)124221084 aut Der programmierte Zelltod humaner Spermatogenesezellen und ejakulierter Spermatozoen Mechanismen der Signaltransduktion und assoziierter Membranveränderungen im physiologischen und pathologischen Kontext im Hinblick auf eine potentielle diagnostische und therapeutische Konsequenz Uwe Paasch Aachen Shaker 2002 XIV, 283 S. Ill. txt rdacontent n rdamedia nc rdacarrier Zugl.: Leipzig, Univ., Habil.-Schr., 2002 Apoptosis (DE-588)4291096-1 gnd rswk-swf Spermazelle (DE-588)4236794-3 gnd rswk-swf Sperma (DE-588)4056167-7 gnd rswk-swf Signaltransduktion (DE-588)4318717-1 gnd rswk-swf Spermatogenese (DE-588)4135384-5 gnd rswk-swf (DE-588)4113937-9 Hochschulschrift gnd-content Spermazelle (DE-588)4236794-3 s Apoptosis (DE-588)4291096-1 s DE-604 Spermatogenese (DE-588)4135384-5 s Signaltransduktion (DE-588)4318717-1 s Sperma (DE-588)4056167-7 s HBZ Datenaustausch application/pdf http://bvbr.bib-bvb.de:8991/F?func=service&doc_library=BVB01&local_base=BVB01&doc_number=010153708&sequence=000002&line_number=0001&func_code=DB_RECORDS&service_type=MEDIA Inhaltsverzeichnis |
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