Inaktivierung des ANX5-Gens in der Maus: Analyse der Genexpression und Funktion
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1
ZUSAMMENFASSUNG
5
2
EINLEITUNG
7
2.1
STRUKTUR
DER
ANNEXINE
7
2.2
EVOLUTION
DER
ANNEXINGENE
9
23
REGULATION
DER
EXPRESSION
UND
AKTIVITAET
DER
ANNEXINE
9
2.4
VERTEILUNG
UND
EXPRESSION
DER
ANNEXINE
IN
VIVO
11
2.5
FUNKTIONEN
DER
ANNEXINE
12
2.6
POTENTIELLE
FUNKTIONEN
VON
ANX5
14
2.7
IN
VIVO
MODELLE
ZUR
FUNKTION
DER
ANNEXINE
15
2.8
WELCHES
SIND
DIE
IN
VIVO
FUNKTIONEN
DES
ANX5?
18
3
AUFGABENSTELLUNG
19
4
ERGEBNISSE
20
4.1
CHARAKTERISIERUNG
DER
ANX5
GENOMSTRUKTUR
20
4.2
INAKTIVIERUNG
DES
ANX5
GENS
IN
ES-ZELLEN
24
43
ERZEUGUNG
VON
ANX5
DEFIZIENTEN
MAEUSESTAEMMEN
29
4.4
ETABLIERUNG
DES
MAUSSTAMMES
A9
30
4.4.1
EXPRESSION
VON
ANX5
IM
MAUSSTAMM
A9
32
4.4.2
EINFLUSS
DER
ANX5
DEFIZIENZ
AUF
DIE
EXPRESSION
DER
ANNEXINE
ANX2
UND
ANX6
38
4.5
ERZEUGUNG
DER
MAEUSESTAEMME
ELI
UND
BLL
39
4.6
EXPRESSION
VON
ANX5
IN
VIVO
43
4.6.1
DETEKTION
VON
ANX5
SPEZIFISCHER
MRNA
43
4.6.2
EXPRESSION
VON
ANX5
PROTEIN
IM
EMBRYO
45
4.63
EXPRESSION
DES
ANX5-LACZ
FUSIONSPROTEINS
IN
DER
EMBRYONALENTWICKLUNG
50
4.6.4
EXPRESSION
VON
ANX5
IN
GEWEBEN
DER
ADULTEN
MAUS
53
4.7
ANALYSE
DES
PHAENOTYPS
VON
ANX5
DEFIZIENTEN
MAEUSEN
58
4.7.1
SKELETTAUFBAU
UND
WACHSTUM
DER
MAEUSE
58
4.7.2
KOAGULATIONSVERHALTEN
60
4.7.3
LEBENSERWARTUNG
62
4.8
KONDITIONALE
GENINAKTIVIERUNG
63
4.9
INTERAKTION
VON
ANX5
MIT
INTEGRINEN
67
5
DISKUSSION
69
5.1
POLYMORPHISMUS
DES
ANX5
GENS
69
5.2
GEZIELTE
INAKTIVIERUNG
DES
ANX5
GENS
70
5.2.1
ERFOLGREICHE
GENERIERUNG
EINES
ANX5
GENDEFEKTEN
MAUSMODEILS
71
5.3
GENOMISCHE
ABERRATION
DES
MAUSSTAMMS
BLL
73
5.4
DER
MAUSSTAMM
A9
REPRAESENTIERT
DAS
ERSTE
ANX5
YYKNOCK
OUT
"
-MODELL
74
5.4.1
ANX5
ALS
NEUARTIGER
MARKER
UNTERSCHIEDLICHER
DIFFERENZIERUNGSPROZESSE
77
5.4.2
SPEZIFISCHE
EXPRESSION
DES
ANX5
IM
VASKULAEREN
SYSTEM
78
5.4.3
EXPRESSION
VON
ANX5
IN
DER
LEBER
79
5.4.4
EXPRESSION
DES
ANX5
WAEHREND
DER
KNORPEL
UND
SKELETTENTWICKLUNG
80
5.4.5
ANX5
DEFIZIENTE
TIERE
ZEIGEN
KEINE
VERAENDERTEN
PHAENOTYP
82
6
MATERIAL
UND
METHODEN
86
6.1
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
86
6.2
ANTIKOERPER
86
6.3
VERWENDETE
BAKTERIENSTAEMME
86
6.4
VEKTOREN
87
6.5
OLIGONUKLEOTIDE:
87
6.6
RADIONUKLEOTIDE
88
6.7
ALLGEMEINE
METHODEN
88
6.7.1
DNA
SEQUENZIERUNG
88
6.8
ZELLKULTUR
89
6.8.1
LOESUNGEN
UND
REAGENZIEN:
89
6.8.2
MURINE
EMBRYONALE
STAMMZELLKULTUR
89
6.8.2.1
ZELLZAHLBESTIMMUNG
90
6.8.2.2
TRYPSINISIEREN
VON
ES-ZELLEN
90
6.8.23
EINFRIEREN
VON
ES-ZELLEN
90
6.8.2.4
AUFTAUEN
VON
ES-ZELLEN
91
6.8.2.5
ISOLIERUNG
UND
KULTIVIERUNG
VON
BLASTOZYSTEN
91
6.8.2.6
PEMF-BESCHICHTUNG
VON
ZELLKULTURPLATTEN
91
6.8.2.7
GELATINEBESCHICHTUNG
VON
ZELLKULTURPLATTEN
91
6.8.2.8
TRANSFEKTION
VON
MURINEN
EMBRYONALEN
STAMMZELLEN
(WURST
ET
AL,
1993)
92
6.8.2.9
VEREINZELUNG
VON
ES-KLONEN
NACH
DER
SELEKTION
92
6.8.2.10
EXPANSION
HOMOLOG
REKOMBINIERTER
KLONE
93
2
6.9
DNA/RNA-ISOLIERUNG
UND
IDENTIFIKATION
93
6.9.1
DNA
ISOLIERUNG
AUS
ES-ZELLEN
EINER
96
LOECHER
PLATTE
93
6.9.1.1
DNA
ISOLIERUNG
AUS
ES-ZELLEN
KULTIVIERT
IN
EINER
10
CM
PLATTE
93
6.9.1.2
DNA
ISOLIERUNG
AUS
MAEUSESCHWAENZEN
94
6.9.1.3
SOUTHERN
TRANSFER
EXPERIMENT
94
6.9.1.4
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
SONDEN
95
6.9.1.5
HYBRIDISIERUNG
95
6.9.1.6
PCR
96
6.9.1.7
RNA-
ISOLIERUNG
AUS
GEWEBEN
(CHOMZYNSKI
AND
SACCHI,
1987)
96
6.9.1.8
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
-
PCR
97
6.10
PROTEINISOLIERUNG
UND
-IDENTIFIZIERUNG
97
6.10.1
PROTEINISOLIERUNG
AUS
GEWEBEN
97
6.10.2
DISKONTINUIERLICHE
PROTEINGELEIELEKTROPHORESE
(LAEMMLI
ET
AL.,
1970)
97
6.10.3
WESTERN
TRANSFER
EXPERIMENT
98
6.11
HISTOLOGIE
98
6.11.1
FIXIERUNG
VON
GEWEBEN
98
6.11.2
DEKALZIFIZIERUNG
VON
GEWEBEN
99
6.11.3
PARAFFINSCHNITTE
99
6.11.4
VIBRATOMSCHNITTE
99
6.11.5
GEFRIERSCHNITTE
100
6.11.6
IMMUNOHISTOCHEMIE
100
6.11.7
NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
100
6.11.8
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
VON
EMBRYOS
101
6.11.8.1
GENERIERUNG
DER
IN
SITU-PROBEN
101
6.11.8.2
PRAEHYBRIDISIERUNG
DER
EMBRYOS
102
6.11.8.3
HYBRIDISIERUNG
UND
NACHWEIS
DER
PROBE
102
6.11.9
MAEUSE
103
6.11.9.1
GENERIERUNG
GENINAKTIVIERTER
MAEUSE
104
6.11.9.2
THROMBOELASTOGRAMM
105
6.11.10
YEAST
TWO
HYBRID
SYSTEM
105
6.11.11
KONSTRUKTE
105
6.11.11.1
PAV-LACZ
106
6.11.11.2
PAV-LACZ-EX5
106
6.11.11.3
PAV-3XLOX+PBSKII(-)
106
6.11.11.4
PAV-3XLOX-DEL-VIRUS
106
6.11.11.5
PEGFP-LOX
107
3
6.11.11.6
PMUTLOXII
107
6.12
VERWENDETE
DATENBANKEN
108
7
LITERATURVERZEICHNIS
109
8
ABKUERZUNGEN
114
9
ANHANG
116
9.1
SYNONYME,
GROESSE
UND
GENOMISCHE
LOKALISATION
VON
ANX1-ANX13
116
9.2
SPLEISSVARIANTEN
IM
ANX5
GEN
DER
RATTE
UND
DER
MAUS
117
9.3
ENTWICKLUNGSABHAENGIGE
EXPRESSION
DES
ANX5-LACZ
FUSIONSGENS
118
9.4
VERGROESSERTE
DARSTELLUNG
VON
ABB.
20
119
9.5
EXPRESSION
DES
ANX5-LACZ
FUSIONSGENS
IM
GEFAESSSYSTEM
(10,5DPC)
UND
IM
SICH
ENTWICKELNDEN
SKELETTSYSTEM(14,5
DPC)
120
9.6
SEQUENZ
DER
MURINEN
ANX5
MRNA
UND
DES
PROTEINS
121
4 |
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