Interaktion der Regulatorproteine IE2 und pp71 des humanen Cytomegalovirus mit Faktoren der nukleären Domäne ND10:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
A.
ZUSAMMENFASSUNG
1
B.
EINLEITUNG
2
C.
FRAGESTELLUNG
6
D.
MATERIAL
UND
METHODEN
7
1.
BIOLOGISCHES
MATERIAL
7
1.1.
BAKTERIEN
7
1.2.
HEFEZELLEN
7
1.3.
GEWEBEKULTURZELLEN
7
1.4.
VIRUSSTAEMME
7
1.5.
SEREN
UND
ANTIKOERPER
7
1.5.1.
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
7
1.5.2.
POLYKLONALE
ANTISEREN
8
1.5.3.
SEKUNDAERANTIKOERPER
8
2.
NUKLEINSAEUREN
8
2.1.
OLIGONUKLEOTIDE
8
2.1.1.
SEQUENZIERPRIMER
9
2.1.2.
PRIMER
FUER
PCR-KLONIERUNG
UND
PCR-MUTAGENESE
9
2.2.
VEKTOREN
UND
PLASMIDE
11
2.2.1.
VEKTOREN
UND
VEKTORSYSTEME
11
2.2.2.
ZUR
VERFUEGUNG
GESTELLTE
PLASMIDE
11
2.2.3.
NEU
KONSTRUIERTE
PLASMIDE
12
2.2.3.1.
HEFEVEKTOREN
12
2.2.3.2.
EUKARYONTE
EXPRESSIONSVEKTOREN
14
2.2.4.
REPORTERKONSTRUKTE
19
2.2.5.
REKOMBINATIONSVEKTOREN,
COSMIDE
UND
BACMIDE
19
2.3.
SONSTIGE
NUKLEINSAEUREN
21
3.
ENZYME,
FEINCHEMIKALIEN
UND
MEDIEN
21
3.1.
ENZYME
21
3.2.
FEINCHEMIKALIEN
22
3.3.
MEDIEN
22
3.3.1.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
BAKTERIEN
22
3.3.2.
MEDIEN
FUER
DIE
ANZUCHT
VON
HEFEZELLEN
22
3.3.3.
MEDIEN
FUER
GEWEBEKULTUREN
23
3.4.
STANDARDPUFFER
23
4.
STANDARDMETHODEN
UND
REAGENZSYSTEME
23
4.1.
IN
VITRO
MUTAGENESE
24
5.
ZELLKULTURVERFAHREN
24
5.1.
ZELLKULTUR
24
5.2.
TRANSFEKTION
UND
INFEKTION
24
5.3.
LUZIFERASEANALYSE
25
5.4.
PROTEIN-STABILITAETSEXPERIMENTE
25
6.
IMMUNFLUORESZENZ-ANALYSEN
26
7.
ANALYSE
VON
PROTEIN/PROTEIN-INTERAKTIONEN
26
7.1.
IMMUNOBLOT
26
7.2.
HEFE-INTERAKTIONSKLONIERUNG
27
7.2.1.
HEFE-TRANSFORMATION
27
7.2.2.
FILTERLIFT-TESTS
27
7.2.3.
ONPG-TESTS
28
7.3.
CO-IMMUNPRAEZIPITATION
28
7.3.1.
CO-IMMUNPRAEZIPITATION
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
28
7.3.2.
CO-IMMUNPRAEZIPITATION
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
28
8.
HERSTELLUNG,
REINIGUNG
UND
ANALYSE
VON
REKOMBINANTEN
VIREN
29
8.1.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
VIREN
(BACMID-TECHNOLOGIE)
29
8.1.1.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
VON
LINEAREN
DNA-FRAGMENTEN
29
8.1.2.
HOMOLOGE
REKOMBINATION
UEBER
DIE
BILDUNG
EINES
CO-INTEGRATS
30
8.2.
KOLONIE-PCR
30
8.3.
PRAEPARATION
UND
RESTRIKTIONSSPALTUNG
VON
BACMID-DNA
31
8.4.
SOUTHERN
BLOT-ANALYSE
31
8.5.
VIRUSTITRATION
31
9.
COMPUTERANALYSEN
32
E.
ERGEBNISSE
33
1.
KOVALENTE
MODIFIKATION
DES
IE2-PROTEINS
DURCH
UBIQUITIN-BOMOLOGE (UBH)
34
POLYPEPTIDE
1.1.
IDENTIFIZIERUNG
DER
INTERAKTION
ZWISCHEN
IE2
UND
PROTEINEN
DES
UBH
34
KONJUGATIONSWEGES
1.2.
NACHWEIS
DER
KOVALENTEN
MODIFIKATION
VON
IE2
DURCH
UBH-POLYPEPTIDE
36
NACH
TRANSIENTER
TRANSFEKTION
1.3.
INDUKTION
DER
IE2-KONJUGATION
UNTER
STRESSBEDINGUNGEN
40
1.4.
NACHWEIS
DER
KOVALENTEN
IE2-MODIFIKATION
WAEHREND
DER
HCMV
41
INFEKTION
1.5.
IDENTIFIZIERUNG
UND
MUTATION
DER
MODIFIKATIONSSTELLEN
IN
IE2
42
1.6.
FUNKTIONSANALYSE
DER
KOVALENTEN
MODIFIKATION
VON
IE2
DURCH
TRANSIENTE
46
EXPRESSIONSEXPERIMENTE
1.6.1.
EINFLUSS
DER
KONJUGATION
AUF
DIE
ASSOZIATION
DES
IE2-PROTEINS
MIT
DER
46
NUKLEAEREN
DOMAENE
ND10
1.6.2.
AUSWIRKUNG
DER
UBH-KONJUGATION
AUF
DIE
STABILITAET
DES
IE2-PROTEINS
47
NACH
TRANSIENTER
EXPRESSION
1.6.3.
EINFLUSS
DER
UBH-MODIFIKATION
AUF
IE2-VERMITTELTE
TRANSAKTIVIERUNG
48
1.7.
HERSTELLUNG
VON
REKOMBINANTEN
CYTOMEGALOVIREN
MIT
SUMOYLIERUNGS
50
NEGATIVEM
IE2
1.7.1.
STRATEGIE
UND
SELEKTION
50
1.7.2.
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
BACMIDE
DURCH
KOLONIE-PCR
53
1.7.3.
VERIFIZIERUNG
DER
REKOMBINANTEN
BACMIDE
DURCH
55
RESTRIKTIONSENZYMVERDAU
UND
SOUTHERN
BLOT-ANALYSEN
1.7.4.
REKONSTITUTION
UND
TITRATION
REKOMBINANTER
CYTOMEGALOVIREN
57
1.8.
ANALYSE
DER
GENEXPRESSION
NACH
INFEKTION
MIT
REKOMBINANTEN
58
CYTOMEGALOVIREN
1.8.1.
EXPRESSIONSKINETIK
DES
IE2-PROTEINS
58
1.8.2.
KINETIK
DER
PROTEINEXPRESSION
IM
VERLAUF
DER
HCMV-REPLIKATION
60
1.9.
ANALYSE
DER
IE2-STABILITAET
NACH
INFEKTION
MIT
REKOMBINANTEN
VIREN
61
2.
INTERAKTION
ZWISCHEN
IE2
UND
WEITEREN
SUMO-1
ASSOZIIERTEN
ZELLULAEREN
63
BINDUNGSPARTNEM
2.1.
INTERAKTION
DER
IE2-BINDUNGSPARTNER
MIT
SUMO-1
IN
HEFEZELLEN
63
2.2.
WECHSELWIRKUNG
ZWISCHEN
IE2
UND
NDLO-ASSOZIIERTEN
PROTEINEN
64
2.2.1.
ASSOZIATION
DER
ZELLULAEREN
FAKTOREN
TOPORS
UND
GBP/PIAS
1
MIT
DER
64
NUKLEAEREN
DOMAENE
NDI0
2.2.2.
BESTAETIGUNG
DER
INTERAKTION
ZWISCHEN
IE2
UND
DEN
FAKTOREN
HDAXX
UND
65
SPLOO
MITTELS
CO-IMMUNPRAEZIPITATION
2.2.3.
EINGRENZUNG
DER
IE2-INTERAKTIONSDOMAENE
IN
HDAXX
67
2.3.
INTERAKTION
ZWISCHEN
IE2
UND
DEM
POLYCOMB-PROTEIN
HEED
68
2.3.1.
BESTAETIGUNG
DER
ASSOZIATION
ZWISCHEN
IE2
UND
HEED
DURCH
CO
68
IMMUNPRAEZIPITATION
2.3.2.
EINGRENZEN
DER
INTERAKTIONSDOMAENEN
IN
IE2
UND
HEED
70
2.3.3.
TRENNUNG
DER
INTERAKTIONSDOMAENEN
ZWISCHEN
IE2
UND
HEED
SOWIE
71
UBIQUITIN-HOMOLOGEN
PROTEINEN
2.3.4.
EINFLUSS
DES
FAKTORS
HEED
AUF
IE2-VERMITTELTE
TRANSAKTIVIERUNG
73
3.
INTERAKTION
DES
TEGUMENTPROTEINS
PP7
1
MIT
DEM
ND
10-PROTEIN
HDAXX
74
3.1.
IDENTIFIZIERUNG
DES
ZELLULAEREN
FAKTORS
HDAXX
ALS
INTERAKTIONSPARTNER
DES
74
TEGUMENTPROTEINS
PP71
MITTELS
HEFE-INTERAKTIONSKLONIERUNG
3.2.
BESTAETIGUNG
DER
INTERAKTION
ZWISCHEN
PP71
UND
HDAXX
DURCH
CO
75
IMMUNPRAEZIPITATION
3.3.
IDENTIFIZIERUNG
DER
PP71-INTERAKTIONSDOMAENE
IN
HDAXX
77
3.4.
SUBNUKLEAERE
LOKALISATION
VON
PP7
1
NACH
TRANSIENTER
EXPRESSION
80
3.4.1.
ASSOZIATION
VON
PP71-GFP
MIT
NDIO-DOMAENEN
80
3.4.2.
REKRUTIERUNG
VON
PP71
IN
NDIO-DOMAENEN
NACH
CO-EXPRESSION
VON
81
HDAXX
3.5.
SUBNUKLEAERE
LOKALISATION
VON
PP71
NACH
HCMV-INFEKTION
83
3.5.1.
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
REKOMBINANTER
CYTOMEGALOVIREN
MIT
83
PP71-GFP
3.5.2.
ND10-ASSOZIATIONDERPP71-TEGUMENTKOMPONENTEINHCMV-INFIZIERTEN
87
ZELLEN
3.6.
IDENTIFIZIERUNG
UND
MUTAGENESE
POTENTIELLER
HDAXX-BINDEMOTIVE
IN
PP7
1
88
3.6.1.
EFFEKT
DER
INTERNEN
DELETION
VON
HDAXX-INTERAKTIONSDOMAENEN
AUF
DIE
88
INTERAKTION
3.6.2.
ANALYSE
DER
HDAXX-INTERAKTIONSMOTIVE
DURCH
DETAILLIERTE
90
PUNKTMUTAGENESE
3.7.
UNTERSUCHUNG
DER
PP71-VERMITTELTEN
TRANSAKTIVIERUNG
NACH
CO
91
EXPRESSION
VON
HDAXX
F.
DISKUSSION
93
G.
ABKUERZUNGEN
109
H.
LITERATURVERZEICHNIS
110 |
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| author | Hofmann, Heike 1971- |
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