Der Transkriptionsaktivator cGvpE aus dem extrem halophilen Archaeon Halobacterium salinarum PHH4: ein basisches Leucinzipper-Protein
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| Format: | Microfilm Book |
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
I. ZUSAMMENFASSUNG 1
II. EINLEITUNG
5
1. HALOPHILE ARCHAEA UND GASVESIKEL 5
2. TRANSKRIPTIONSINITIATION IN ARCHAEA 15
3. TRANSKRIPTIONSREGULATOREN IN ARCHAEA 22
4. TRANSKRIPTIONSAKTIVATOR GVPE
- EIN BASISCHES LEUCINZIPPER-PROTEIN AUS ARCHAEA 27
\\\.
MATERIAL UND METHODEN 36
1. MATERIAL _ 36
1.1 MATERIALIEN, CHEMIKALIEN UND BIOCHEMIKALIEN 36
1.2 VEKTOREN UND IHRE RESISTENZGENE
37
1.3 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 38
1.4 MIKROORGANISMEN 38
1.5 ENZYME UND KITS
39
1
.6
DNA- UND PROTEIN-GROESSENSTANDARDS
39
1.7 MEDIEN
39
1
.8
PUFFER UND LOESUNGEN 40
2. METHODEN 42
2.1 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 42
2.2
GERICHTETE PCR-MUTAGENESE
43
2.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE UND GELELUTION VON DNA-FRAGMENTEN 45
2.4 PRAEZIPITATION VON DNA UND BESTIMMUNG DER DNA-KONZENTRATION 46
2.5 RESTRIKTION UND LIGATION VON DNA 46
2.6 TRANSFORMATION UND ANZUCHT VON
E. COLI 46
2.7 TRANSFORMATION VON
HALOFERAX VOLCANII WFD11 UND ANZUCHT VON
HALOBAKTERIELLEN TRANSFORMANTEN
46
2.8 PLASMIDPRAEPARATION AUS
E. COLI
YY
'
47
2.9 PLASMIDPRAEPARATION AUS HALOBAKTERIEN 48
2.10 SEQUENZIERUNG VON PLASMID-DNA
48
2.11 SOUTHERN-ANALYSE
49
2.12 ISOLIERUNG VON GESAMT-RNA AUS HALOBAKTERIEN
50
2.13 NORTHERN-ANALYSE
51
2.14 ISOLIERUNG DER LOESLICHEN PROTEINE AUS HALOBAKTERIEN 52
2.15 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 52
2.16 SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE VON PROTEINEN
53
2.17 WESTERN-ANALYSE
53
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.18 BLAU-NATIVE POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 54
2.19 AUFREINIGUNG VON CGVPE-HIS DURCH NI-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE
55
2.20 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET VON
HALOBAKTERIELLEN TRANSFORMANTEN 56
2.21
ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY 57
2.22
MAGNETIC DNA AFFINITY CHROMATOGRAPHY 58
2.23
UV-CROSSLINKING 60
IV. ERGEBNISSE 62
1.
IN WFRO-MUTAGENESE DER AH4- UND AH6-REGION DES
HALOBAKTERIELLENTRANSKRIPTIONSAKTIVATORS CGVPE 63
1.1 MEGAPRIMER-PCR ZUR MUTATION DER AH4- UND AH6-REGION DES C-GVPE-GENS
65
1.2 KLONIERUNG DER MUTIERTEN C-GVPE-GENE IN DEN HALOBAKTERIELLEN
EXPRESSIONS
VEKTOR PJAS35 UND HERSTELLUNG VON HALOFERAX VOLCANII WFD11 -
TRANSFORMANTEN 67
1.3 SOUTHERN-ANALYSE DER HALOBAKTERIELLEN TRANSFPRMANTEN
CAZEZIP
UND
CA/EAH4
69
1.4 UNTERSUCHUNG DER C-GVPE UND C-GVPA-EXPRESSION IN DEN
HALOBAKTERIELLEN
TRANSFORMANTEN
CA/EZIP
UND
CA/EAH4
DURCH WESTERN-ANALYSE
71
2. SPEZIFISCHE SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET DER HALOBAKTERIELLEN
MCA-BGAH/EZIP- UND MCA-BGAH/EAH
4
-TRANSFORMANTEN 76
2.1 SOUTHERN-ANALYSE DER MCA/E-TRANSFORMANTEN 78
2.2 WESTERN-ANALYSE DER MCA/E-TRANSFORMANTEN 79
2.3 BESTIMMUNG DER SPEZIFISCHEN SS-GALAKTOSIDASE-AKTIVITAET IN DEN
VERSCHIEDENEN
MCA/E-TRANSFORMANTEN 80
3. EXPRESSION DES CGVPE ALS /I/S-FAG-FUSIONSPROTEIN IN
HALOFERAX VOLCANII WFD11 UND AUFREINIGUNG DURCH NI-NTA-
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 86
3.1 FUNKTIONELLE ANALYSERI DER A/E-HIS-HF.
VOL.-TRANSFORMANTEN 87
3.2 AUFREINIGUNG DES CGVPE-HIS-FUSIONSPROTEINS AUS
CA/E-HIS-TRANSFORMANTEN UEBER NI-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 89
3.3 DIMERISIERUNG DES CGVPE-HIS-PROTEINS AUS HALOFERAX VOLCANII-
TRANSFORMANTEN
91
3.4 BLAU-NATIVE POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE VON CGVPE-HLS AUS
HALOFERAX VOLCANII-JRANSFORMANTEN 92
4. DIMERISIERUNG DER CGVPEZIP- UND CGVPEAH
4
-MUTANTEN 93
5. EXPRESSION DES CGVPE ALS FI/S-FAG-FUSIONSPROTEIN IN
E. COLI BL21 (DE3) UND AUFREINIGUNG DURCH NI-NTA-
AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 95
5.1 KLONIERUNG VON C-GVPE-HIS IN DEN EXPRESSIONSVEKTOR PET11D 96
5.2 EXPRESSION VON C-GVPE-HIS IN E.
COLI BL21 (DE3) UND
AUFREINIGUNG DURCH NI-NTA-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 97
INHALTSVERZEICHNIS
5.3 DIMERISIERUNG DES CGVPE-HIS AUS
E. COLI BL21 (DE3) 98
6. UNTERSUCHUNG DER BINDUNG DES CGVPE-PROTEINS AN DAS
C-GVPA-
BZW. MC-GVPA-PROMOTORFRAGMENT 99
6.1
ELECTROPHORETIC MOBILITY SHIFT ASSAY 99
6.2
MAGNETIC DNA AFFINITY CHROMATOGRAPHY 102
6.3
UV-CROSSLINKING 104
7. EINFLUSS DER SALZKONZENTRATION AUF DIE EXPRESSION DES
C-GVPE-,
C-GVP-HIS- UND C-GVPA-GENS IN HF. VOLCANII-TRANSFORMANTEN 106
7.1 WACHSTUMSKURVEN BEI NIEDRIG- UND HOCHSALZBEDINGUNGEN 107
7.2 NORTHERN-ANALYSE ZUR UNTERSUCHUNG DER TRANSKRIPTION VON
C-GVPE,
C-GVPE-HIS UND C-GVPA 109
7.3 WESTERN-ANALYSE ZUR UNTERSUCHUNG VON CGVPE UND CGVPE-HIS BEI
UNTERSCHIEDLICHEN SALZKONZENTRATIONEN 111
V. DISKUSSION 113
\
1. MUTATIONEN IN DER AMPHIPHILEN AH6-REGION VON CGVPE BEEIN
TRAECHTIGEN DIE AKTIVITAET DES TRANSKRIPTIONSAKTIVATORS IN VIVO 114
2. MUTATIONEN IN DER AH4- REGION BEEINFLUSSEN DIE AKTIVIERENDE
FUNKTION VON CGVPE IN VIVO 120
3. AUFREINIGUNG UND DIMERISIERUNGSSTUDIEN DES CGVPE-HIS-
FUSIONSPROTEINS AUS HALOFERAX VOLCANII 125
4. DIMERISIERUNG DER CGVPEZIP- UND CGVPE
AH
4
-MUTANTEN 127
5. AUFREINIGUNG DES CGVPE-HIS-FUSIONSPROTEINS AUS .
COLI 131
6. UNTERSUCHUNG DER DNA-BINDUNG DES CGVPE-PROTEINS 131
7. EINFLUSS DER SALZKONZENTRATION AUF DEN FERREDOXIN-PROMOTOR
SOWIE AUF DIE AKTIVATORFUNKTION DES CGVPE-PROTEINS AM
CA-PROMOTORS IN HF. VOLCANII-TRANSFORMANTEN 137
VI. LITERATURVERZEICHNIS 140
VII. ABKUERZUNGEN 152
VIII. ANHANG 153 |
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