Untersuchungen zur Signaltransduktion in Chironomus tentans:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
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| Beschreibung: | Ulm, Univ., Diss., 2002 |
| Beschreibung: | 88 Bl. Ill., graph. Darst. : 30 cm |
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS.1
EINLEITUNG.4
I. 1. HORMONE.4
I. 2. MEMBRANSTAENDIGE REZEPTOREN.4
I. 3. INTRAZELLULAERE REZEPTOREN. 4
I. 4. NICHT-GENOMISCHE STEROIDHORMONWIRKUNGEN.5
I. 5. ECDYSTEROIDE.5
I. 6. EPITHELIALE ZELL-LINIE VON CHIRONOMUS IENTANS.5
I. 7. CYCLISCHES PROSTAGLANDYLINOSITOLPHOSPHAT.6
I. 8. ECR UND USP.6
I. 9. BAKTERIELLE EXPRESSION UND REINIGUNG VON ECR UND USP. 7
I. 10. REALZEIT-UNTERSUCHUNGEN VON BINDUNGSREAKTIONEN.8
I. 11. ZIELE DER ARBEIT. 9
MATERIAL UND METHODEN.10
II. 1. MATERIAL.10
II. 1.1. CHEMIKALIEN.10
II. 1.2. GERAETE.11
II. 2. METHODEN. 13
II. 2.1. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN.13
II. 2.1.1. ANZUCHT DER ZELLEN.13
II. 2.1.2. INKUBATION DER ZELLEN MIT 20-OH-ECDYSON.13
II. 2.1.3. HERSTELLUNG VON ZELLHOMOGENATEN.14
II. 2.1.4. HERSTELLUNG VON CYTOSOL.14
II. 2.1.5. ULTRAZENTRIFUGATION.14
II. 2.1.6. HERSTELLUNG VON ZELLEXTRAKTEN FUER FILTERTESTS UND EMSAS.14
II. 2.2. PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.15
II. 2.2.1. PROTEINBESTIMMUNG.15
II. 2.3. METHODEN ZUR UNTERSUCHUNG VON CPIP.16
II. 2.3.1. CPIP-TEST_ 16
II. 2.3.2. KIESELGEL-CHROMATOGRAPHIE.17
II. 2.33. AUSWERTUNG DER KIESELGEL-CHROMATOGRAPHIE.18
II. 2.3.4. ABSORPTIONSCHROMATOGRAPHIE AN EINER RP C]8-SAEULE (HPLC).18
II. 2.3.5. AUSWERTUNG DER HPLC.19
II. 2.3.6. ABTRENNUNG DES NIEDERMOLEKULAREN CO-SUBSTRATES.19
II. 2.3.6.I. GELFILTRATION MIT G-15.20
II. 2.3.6.2. GELFILTRATION MIT G-25-SAEULEN.20
II. 2.3.6.3. ZENTRIFUGATION MIT 10 KDA-FILTERN.21
II. 2.3.6.4. ZENTRIFUGATION MIT 30 KDA, 100 KDA-FILTERN.21
II. 2.3.7. KREUZTEST CHIRONOMUS - RATTE.21
1
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II. 2.3.8. BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTES DES ENZYMES AUS
CHIRONOMUS-ZELLEN.
22
II. 2.4. METHODEN ZUR EXPRESSION UND CHARAKTERISIERUNG
VON ECR UND USP. 23
II. 2.4.1. ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA UND TRANSFORMATION KOMPETENTER
BL21(DE3)-ZELLEN_23
II. 2.4.2. BAKTERIELLE EXPRESSION VON GST-ECR UND GST-USP.23
II. 2.4.3. HERSTELLEN VON E. CO#-ROHEXTRAKTEN.T.23
N. 2.4.4. REINIGUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN MIT GLUTATHION-
SEPHAROSE IM BATCH-VERFAHREN.24
II. 2.4.5. REINIGUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN MIT GLUTATHION-
SEPHAROSE IM SAEULENVERFAHREN.24
II. 2.4.6. DIREKTE KOPPLUNG VON GLUTATHION-MAGNETBEADS.25
II. 2.4.7. SPACER-VERMITTELTE KOPPLUNG VON GLUTATHION-MAGNETBEADS.26
II. 2.4.8. REINIGUNG MIT GLUTATHION-MAGNETBEADS.26
II. 2.4.9. HORMON-BINDUNGSTEST. 27
II. 2.4.10. FLUORESZENZ-KORRELATIONS-SPEKIROSKOPIE.27
II. 2.4.11. EMSA-QUALITATIV.28
II. 2.4.12. EMSA - QUANTITATIV.29
II. 2.4.13. FILTERTEST ZUR DNA-BINDUNG.29
ERGEBNISSE.31
III. 1. DER SECOND MESSENGER CPIP IN
CHIRONOMUS.31
III. 1.1. OPTIMIERUNGEN.31
III. 1.1.1. OPTIMIERUNG DER ZELLKULTUR.31
III. 1.1.2. OPTIMIERUNG DER AUFARBEITUNG DER ZELLEN.31
IN. 1.2. CHARAKTERISIERUNG DES REAKTIONSPRODUKTES.32
III. 1.2.1. KIESELGEL-CHROMATOGRAPHIE.32
III. 1.2.2. ABSORPTIONSCHRO'MATOGRAPHIE MIT EINER RP C,8-SAEULE
(HPLC).33
III. 1.2.3. VERGLEICH DER REAKTIONSPRODUKTE DER ENZYME AUS RATTE UND
CHIRON OM
US-ZELLEN.34
III. 1.3. ISOLIERUNG EINES CO-SUBSTRATES AUS CHIRONOMUS-ZEWEN.35
III. 1.3.1. ISOLIERUNG VON CO-SUBSTRAT NACH WASNER.35
III. 1.3.2. ABTRENNUNG DER NIEDERMOLEKULAREN FRAKTION DUERCH FILTRATION
(AUSSCHLUSSGRENZE 10 KDA).35
III. 1.3.3. GELFILTRATION MIT
G-25-SAEULE.36
III. 1.3.4. ZENTRIFUGATION MIT 30 KDA, 100 KDA-FILTERN.37
III. 1.3.5. KREUZTEST CHIRONOMUS - RATTE
.38
IH. 1.4. CHARAKTERISIERUNG DES
CHIRONOMUS-ENZYMES.39
III. 1.4.1. LOKALISATION DES
ENZYMES.
39
III. 1.4.2. BESTIMMUNG DES MOLEKULARGEWICHTES DURCH
GELFILTRATION. 41
III. 1.5. ATP-ABHAENGIGKEIT DER REAKTION.42
III. 1.6. EINFLUSS VON HORMONEN AUF DIE ENZYMAKTIVITAET.44
III. 1.6.1. 20-OH-ECDYSON.44
2
INHALTSVERZEICHNIS
III. 1.6.2. INSULIN._45
III. 2. ECR/USP: EXPRESSION, REINIGUNG UND
CHARAKTERISIERUNG DER REZEPTOREN.46
III. 2.1. EXPRESSION VON ECR-GST UND USP-GST.46
III. 2.2. REINIGUNG VON ECR-GST SOWIE USP-GST.46
III. 2.2.1. REINIGUNG VON ECR-GST SOWIE USP-GST IM BATCH-VERFAHREN
UND NACHWEIS DER
FUNKTIONALITAET.
46
III. 2.2.2. REINIGUNG VON GST-FUSIONSPROTEINEN MIT GLUTATHION-SEPHAROSE
IM
SAEULENVERFAHREN.
48
III. 2.2
3. REINIGUNG VON GST MIT MAGNETBEADS. 49
III. 2.3. FCS-UNTERSUCHUNGEN VON ECR-GST UND USP-GST.51
III. 2.4. VERGLEICH DER DNA-BINDUNG ZWISCHEN BAKTERIELL EXPRIMIERTEN
REZEPTOREN UND ZELLEXTRAKT VON CHIRONOMUS TENTANS.53
III. 2.5. ERMITTLUNG DER AFFINITAET ZWISCHEN REZEPTOR UND DNA
MITEMSA. 55
III. 2.6. ERMITTLUNG DER AFFINITAET ZWISCHEN REZEPTOR UND DNA
MIT FILTERTEST. 56
III. 2.7. UNTERSUCHUNG DES EINFLUSSES VON CHAPERONEN AUF
GEREINIGTE REZEPTOREN.61
DISKUSSION. 64
IV. 1. DER SECOND MESSENGER CPIP IN DER EPITHELIALEN ZELL-LINIE
VON CHIRONOMUS TENTANS.64
IV. 2. DER ECDYSTEROIDREZEPTOR ECR UND SEIN
HETERODIMERISIERUNGSPARTNER USP.68
ZUSAMMENFASSUNG.75
SUMMARY.76
LITERATURVERZEICHNIS. 77
ABKUERZUNGEN.86
DANKSAGUNG.88
3 |
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