Herstellung von Serotyp 1-/Serotyp 2-Reassortanten des Virus der infektiösen Bursitis (IBDV) und Bestimmungen einiger biologischer Eigenschaften in vitro:
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INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG/
LITERATURUEBERSICHT
1
1.1
DAS
VIRUS
DER
INFEKTIOESEN
BURSITIS
1
1.2
PATHOGENESE
DER
ERKRANKUNG
1
1.3
KLINIK
2
1.4
SEROTYP
1
2
1.4.1
YYKLASSISCH
"
VIRULENTE
IBDV-STAEMME
3
1.4.2
VARIANTSTAEMME
3
1.4.3
HOCHVIRULENTE
IBDV-STAEMME
-3
1.5
SEROTYP
2
4
1.6
GENOMSTRUKTUR
5
1.7
IMMUNOGENE
EIGENSCHAFTEN
DER
VIRUSPROTEINE
7
1.8
APOPTOSE
9
1.9
DIE
ENTWICKLUNG
REVERSER
GENETISCHER
SYSTEME
9
1.10
DIAGNOSTIK
VON
IBDV-INFEKTIONEN
10
1.11
ZIEL
DER
ARBEIT
11
2
MATERIAL
UND
METHODEN
12
2.1
MATERIAL
12
2.1.1
GERAETE
UND
VERBRAUCHSMATERIAL
12
2.1.1.1
GERAETE
12
2.1.1.2
VERBRAUCHSMATERIALIEN
12
2.1.1.3
SOFTWARE
13
2.1.2
BIOLOGISCHE
MATERIALIEN
13
2.1.2.1
BEFRUCHTETE
HUEHNEREIER
13
2.1.2.2
BAKTERIEN
13
2.1.2.3
VIREN
13
2.1.2.3.1
SEROTYP
1
13
2.1.2.3.2
SEROTYP
2
15
2.1.2.4
PLASMIDE
15
2.1.2.4.1
PBLUESCIPT
II
SK(+)
15
2.1.2.4.2
PUC18
15
2.1.2.4.3
PQE-60
15
2.1.2.4.4
PCR-XL-TOPO
16
2.1.2.5
ENZYME
16
2.1.2.6
ANTIKOERPER
16
2.1.2.7
OLIGONUKLEOTIDE
(PRIMER)
16
2.1.2.8
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
19
2.1.2.8.1
DNA-LAENGENSTANDARD
MV1/PAT
19
2.1.2.8.2
DNA-LAENGENSTANDARD
XHAELLL
19
2.1.2.8.3
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
FUER
PROTEINE
20
2.1.2.8.4
BIOTINYLIERTER
MOLEKULARGEWICHTSMARKER
FUER
PROTEINE
20
2.1.3
VORGEFERTIGTE
SYSTEME
(YYKITS
"
)
20
2.1.4
LOESUNGEN,
PUFFER
UND
MEDIEN
20
2.2
METHODEN
21
2.2.1
ZELLKULTUREN
21
2.2.2
VIRUS
21
2.2.2.1
SAATVIRUS
21
2.2.2.2
VIRUSREINIGUNG
UND
-KONZENTRIERUNG
22
2.2.2.3
ANZUECHTUNG
IN
SPF-EIEM
23
2.2.3
PLAQUETEST
23
2.2.4
EXTRAKTION
DER
VIRALEN
RNA
24
2.2.5
REVERSE
TRANSKRIPTION-POLYMERASE-KETTENREAKTION
(RT-PCR)
24
2.2.5.1
REVERSE
TRANSKRIPTION
(RT)
24
2.2.5.2
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
25
2.2.5.3
R
T-PCR
DER
RNA
FUER
DIE
DIREKTSEQUENZIERUNG
26
2.2.6
AGAROSE-GEL-ELEKTROPHORESE
26
2.2.7
KLONIERUNG
VON
DNA
IN
ESCHERICHIA
COLI
(E.
COLI)
27
2.2.7.1
PLASMIDPRAEPARATION
AUS
E.
COLI
27
2.2.7.2
RESTRIKTIONSENZYMSPALTUNG
27
2.2.7.3
KLENOW-REAKTION
28
2.2.7.4
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
(GENE
CLEAN)
28
2.2.7.5
LIGATION
29
2.2.7.6
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
E.
COLI
29
2.2.7.7
TRANSFORMATION
29
2.2.7.8
TOPO-TA-KIONIERUNG
29
2.2.7.9
DNA
-SEQUENZIERUNG
3
0
2.2.8
ELEKTROPHORESE
UND
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
31
2.2.8.
INATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS
31
PAGE)
UND
COOMASSIE-FAERBUNG
2.2.8.2
WESTERN
BLOT
31
2.2.8.3
INDIREKTER
IMMUNFLUORESZENZTEST
32
2.2.9
TRANSKRIPTION
UND
TRANSFEKTION
32
2.2.9.
1
IN
CWN-TRANSKRIPTION
AUS
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDEN
"
32
2.2.9.2
TRANSFEKTION
VON
HEFMIT
RNA-TRANSKRIPTEN
33
2.2.9.3
TRANSFEKTION
DER
CAM
MIT
RNA-TRANSKRIPTEN
34
2.2.10
ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE
UNTERSUCHUNG
34
3
ERGEBNISSE
35
3.1
HERSTELLUNG
DER
PLASMIDE
35
3.1.1
HERSTELLUNG
VON
INFEKTIOESEN
YYVOLLE-LAENGE-PLASMIDEN
"
35
3.1.1.1
HERSTELLUNG
DES
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDS
"
VON
SEGMENT
A
DES
35
STAMMES
CU-1
3.1.1.2
HERSTELLUNG
DES
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDS
"
VON
SEGMENT
B
DES
37
STAMMES
CU-1
3.1.1.3
HERSTELLUNG
DES
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDS
"
VON
SEGMENT
A
DES
3
7
STAMMES
23/82
3.1.1.4
HERSTELLUNG
DES
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDS
"
VON
SEGMENT
B
DES
38
STAMMES
23/82
3.1.1.5
HERSTELLUNG
DES
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDS
"
VON
SEGMENT
A
DES
39
STAMMES
849VB
3.1.1.6
HERSTELLUNG
DES
YY
VOLLE-LAENGE-PLASMIDS
"
VON
SEGMENT
B
DES
39
STAMMES
849VB
3.1.2
SEQUENZIERUNG
DER
YYVOLLE-LAENGE-PLASMIDE
"
40
3.1.2.1
SEQUENZIERUNG
VON
PUCCU-LA
40
3.1.2.2
SEQUENZIERUNG
VON
PVCCU-LB
42
3.1.2.3
SEQUENZIERUNG
VON
PUC23/82A
42
3.1.2.4
SEQUENZIERUNG
VON
PUC23/82B
43
3.2
TRANSFEKTION
DER
INFEKTIOESEN
YYVOLLE-LAENGE-PLASMIDE
"
;
PASSAGIEREN
DER
45
KULTURUEBERSTAENDE
3.2.1
IN
VI'ZRO-TRANSKRIPTION
45
3.2.2
TRANSFEKTION
46
3.2.2.1
OPTIMIERUNG
DER
TRANSFEKTIONSTECHNIK
46
3.2.2.2
GENERIERUNG
INFEKTIOESER
NACHKOMMEN
IN
HEF
4
7
3.2.2.3
GENERIERUNG
INFEKTIOESER
NACHKOMMEN
IM
EMBRYONIERTEN
HUEHNEREI
48
3.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
MITTELS
REVERSER
GENETIK
HERGESTELLTEN
VIREN
CU-LR
49
UND
23/82R
SOWIE
DER
REASSORTANTEN
CU-U-23/820
UND
23/82/1-CU-LAE
3.3.1
IMMUNFLUORESZENZTECHNIK
49
3.3.2
RT-PCR
UND
RESTRIKTIONSENZYMANALYSE
51
3.3.3
DARSTELLUNG
DER
VIRALEN
STRUKTURPROTEINE
IM
WESTERN
BLOT
52
3.3.4
GRADIENTENREINIGUNG
UND
ELEKTRONENMIKROSKOPIE
53
3.4
BIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
MITTELS
REVERSER
GENETIK
HERGESTELLTEN
VIREN
55
CU-LR
UND
23/82R
SOWIE
DER
REASSORTANTEN
CU-L/L-23/82B
UND
23/82/1-CU
\B
3.4.1
PLAQUETEST
55
3.4.2
VIRUSREPLIKATION
IN
HEF
57
3.5
CHARAKTERISIERUNG
DER
MITTELS
REVERSER
GENETIK
HERGESTELLTEN
VIREN
59
849VBR
UND
CU-U-849VBSS
3.5.1
IMMUNFLUORESZENZTECHNIK
59
3.5.2
RT-PCR
UND
RESTRIKTIONSENZYMANALYSE
59
3.6
BIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
REASSORTANTE
CU-1/1-849VBB
61
3.7
SEQUENZIERUNG
DES
FUER
DIE
VARIABLE
REGION
DES
VP2
KODIERENDEN
63
GENOMABSCHNITTS
3.7.1
NUKLEOTIDSEQUENZANALYSE
DER
VARIABLEN
REGION
DES
VP2
68
3.7.1.1
VERGLEICH
DER
SEQUENZEN
DER
AFRIKANISCHEN,
CHINESISCHEN
UND
68
EUROPAEISCHEN
IBDV-STAEMME
3.7.1.2
VERGLEICH
DER
SEQUENZEN
DER
NIGERIANISCHEN
IBDV-ISOLATE
68
3.7.2
VERGLEICH
DER
AMINOSAEURESEQUENZEN
DER
VARIABLEN
REGION
DES
VP2
70
3.7.2.1
VERGLEICH
DER
VARIABLEN
REGION
DES
VP2
MIT
YY
KLASSISCH
"
VIRULENTEN
70
IBD
V-STAEMMEN
3.7.2.2
VERGLEICH
DER
VARIABLEN
REGION
DES
VP2
MIT
ATTENUIERTEN
1BDV
70
STAEMMEN
3.7.3
PHYLOGENETISCHE
ANALYSE
73
3.8
RT-PCR
UND
RESTRIKTIONSENZYMANAIYSE
(REA)
ZUR
SCHNELLEN
74
CHARAKTERISIERUNG
HV-IBDV-STAEMME
4
DISKUSSION
76
4.1
HERSTELLUNG
VON
YYVOLLE-LAENGE-PLASMIDEN
"
76
4.2
TRANSFEKTION
DER
YYVOLLE-LAENGE-PLASMIDE
"
UND
PASSAGIERUNG
DER
77
KULTURUEBERSTAENDE
4.3
CHARAKTERISIERUNG
DER
MITTELS
REVERSER
GENETIK
HERGESTELLTEN
VIREN
79
4.4
BIOLOGISCHE
EIGENSCHAFTEN
DER
MITTELS
REVERSER
GENETIK
HERGESTELLTEN
VIREN
81
4.5
SEQUENZANALYSEN
DES
FUER
DIE
VARIABLE
REGION
DES
VP2
KODIERENDEN
82
GENOMABSCHNITTS
4.6
SCHNELLE
IDENTIFIZIERUNG
HV-IBDV-STAEMME
MITTELS
RT-PCR
UND
85
ANSCHLIESSENDER
RESTRIKTIONSENZYMANAIYSE
4.7
SCHLUSSBETRACHTUNG
86
5
ZUSAMMENFASSUNG
88
6
SUMMARY
91
7
LITERATURVERZEICHNIS
93
ANHANG
A
112 |
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