Analyse der Interaktion von zwei Coxsackievirus-B3-Varianten mit den zellulären Rezeptorproteinen Coxsackievirus-Adenovirus-Rezeptor (CAR) und Decay-Accelerating Factor (DAF):
Gespeichert in:
| 1. Verfasser: | |
|---|---|
| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
Tübingen
[Selbstverl.]
2002
|
| Schlagworte: | |
| Online-Zugang: | Inhaltsverzeichnis |
| Beschreibung: | Zugl.: Tübingen, Univ., Diss., 2002 (Nur beschränkt für den Austausch) |
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INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
KLASSIFIZIERUNG
DES
COXSACKIEVIRUS
.
1
1.2.
PATHOGENESE
DER
COXSACKIEVIRALEN
ERKRANKUNG
.
1
1.3.
GENOM
UND
KAPSIDAUFBAU
DES
COXSACKIEVIRUS
.
2
1.4.
INFEKTIONSZYKLUS
DES
COXSACKIEVIRUS
.
4
1.5.
PICOMAVIRALE
REZEPTOREN
.
7
1.6.
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
.
12
2.
MATERIAL.
13
2.1.
ZELLLINIEN
.
13
2.2.
VIREN
.
13
2.3.
BAKTERIEN
.
13
2.4.
PLASMIDE
.
13
2.5.
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
.
13
2.5.1
PRIMAERE
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
.
13
2.5.2.
SEKUNDAERE
ANTIKOERPER
UND
ANTISEREN
.
13
2.6.
ENZYME
.
13
2.7.
KITS
.
14
2.8.
ELEKTROPHORESE-STANDARDS
.
14
2.9.
SYNTHETISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
14
2.10.
RADIOAKTIVE
SUBSTANZEN
.
14
2.11.
CHEMIKALIEN
UND
MEDIEN
.
14
2.12.
GERAETE
UND
LABORHILFSMITTEL.
16
2.13.
VERBRAUCHSMATERIALIEN
.
16
3.
METHODEN
.
17
3.1.
KULTIVIERUNG
UND
TRANSFEKTION
VON
ZELLEN
.
17
3.1.1.
KULTIVIERUNG
VON
SAEUGETIER-ZELLLINIEN
.
17
3
1.1.1.
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
UND
SUBKULTIVIERUNG
.
17
3.1
1.2
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
DER
ZELLEN
.
17
3.1.1.3.
ZELLZAHLBESTIMMUNG
IM
HAEMOZYTOMETER
(NEUBAUER-ZAEHLKAMMER)
.
18
3.1
2.
HERSTELLUNG
STABIL
TRANSFIZIERTER
ZELLHNIEN
.
18
3
1.2
1.
TRANSFEKTION
NACH
DER
KALZIUM-PHOSPHAT-METHODE
.
18
3.1.2.2.
SELEKTION
STABIL
TRANSFIZIERTER
KLONE
(SUBKLONIERUNG)
.
18
INHALTSVERZEICHNIS
3.1.3
KULTIVIERUNG
VON
INSEKTENZELLLINIEN
.
19
3
1.3.1.
KULTIVIERUNGSBEDINGUNGEN
UND
SUBKULTIVIERUNG
.
19
3.1.3.1.1
KULTIVIERUNG
ADHAERENTER
ZELLEN
.
19
3.1.3.1.2.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
IN
SUSPENSION
.
19
3.1.3.2.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
.
19
3.2.
VIROLOGISCHE
TECHNIKEN
.
20
3.2.1.
VIRUSANZUCHT
UND
AUFREINIGUNG
.
20
3.2.1
1
VIRUSANZUCHT
.
20
3.2.1.2
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
CVB
.
20
3.2.1
3
VIRUSAUFREINIGUNG
UEBER
SUCROSEKISSEN
.
21
3.2.1.4
VIRUSAUFREINIGUNG
UEBER
SUCROSEGRADIENT
.
21
3.2.1.5.
TITERBESTIMMUNG
MITTELS
PLAQUE-/FSSQY
.
22
3.2.2.
VOPBA
(VIRUS
OVERLAY
PROTEIN
BINDING
ASSAY)
.
23
3.2.3.
VIRUSBINDUNGS-4SJOY
.
23
3.2.4
ZEITVERLAUF
DES
VIRALEN
WACHSTUMS
.
24
3.2.5
BESTIMMUNG
DER
REZEPTOREXPRESSION
IM
VERLAUF
DER
CVB-INFEKTION
.
24
3.2.6.
BESTIMMUNG
ZYTOPATHISCHER
EFFEKTE
.
25
3.2.7.
INHIBITION
DER
CVB-INFEKTION
.
25
3.2.7.1.
ANTIKOERPER-VERMITTELTE
INHIBITION
.
25
3.2.7.2.
DURCH
LOESLICHEN
REZEPTOR
VERMITTELTE
INHIBITION
.
26
3.2.8.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
.
26
3.2
8
1
TRANSFEKTION
VON
SF9-ZELLEN.
.
26
3.2.8
2.
PLAQUE-ZFSSQY
.
27
3.2
8.2.1
AUFREINIGUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
MITTELS
PLAQUE-ASSQY
.
27
3.2.8.2.2
VIRUSTITER-BESTIMMUNG
MITTELS
PLAQUE-?TAQY
.
27
3.2.8.3
ANZUCHT
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
.
28
3.2.8.4.
ISOLIERUNG
BACULOVIRALER
DNA
FUER
PCR-ANALYSEN
.
28
3
2.8.5.
HERSTELLUNG
EINES
HIGH-TITER-N
IRUSSTOCKS
.
28
3.3.
KLONIERUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN.
29
3.3.1.
SPALTUNG
VON
DNA
MIT
RESTRIKTIONS-ENDONUKLEASEN
.
29
3.3
2.
AGAROSE-GELELEKTROPHORESE
.
29
3.3.3.
ELUTION
VON
DNA
AUS
EINEM
AGAROSEGEL
.
29
3.3.4.
AUFREINIGUNG
VON
DNA
MITTELS
PHENOL/CHLOROFORM-EXTRAKTION
.
30
3.3.5.
AUFFUELLEN
VON
5
'
-UEBERHAENGEN
.
30
3.3.6.
DEPHOSPHORYLIERUNG
DES
VEKTORS
.
30
3.3.7.
LIGATION
.
31
3.3.8.
HERSTELLUNG
UND
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
COLI
.
31
3.3.8.1.
HERSTELLUNG
KOMPETENTER
COLI
.
31
3.3.8.2
TRANSFORMATION
.
32
3.3.9.
ANLEGEN
VON
GLYCERINSTOCKS
EINER
-CO/I-KULTUR
.
32
3.3.10
PLASMID-ISOLIERUNG
AUS
BAKTERIEN
.
32
3.3.10.1.
PLASMID-AUFREINIGUNG
IN
KLEINEM
MASSSTAB
.
32
3.3.10.2
PLASMID-AUFREINIGUNG
MIT
DEM
QIAFILTER
PLASMID
MAXI
KIT
.
33
3.3.11.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
33
3.3.11
I.
KLONIERUNG
VON
PCR-FRAGMENTEN
NACH
EINFUEHRUNG
VON
RESTRIKTIONS
ENDONUKLEASE-SCHNITTSTELLEN
.
34
INHALTSVERZEICHNIS
3.3.12.
SEQUENZIERUNG
.
34
3.3
12.1.
SEQUENZIERREAKTION
.
34
3.3
12.2.
AUFREINIGUNG
DER
DNA-FRAGMENTE
.
35
3.4.
TECHNIKEN
ZUR
PROTEINEXPRESSION
UND
PROTEINAUFREINIGUNG.
35
3.4.1.
EXPRESSION
REKOMBINANTER
FUSIONSPROTEINE
IN
BAKTERIEN
.
35
3.4.1.1
INDUKTION
DER
EXPRESSION
REKOMBINANTER
FUSIONSPROTEINE
.
35
3
4.1.2
BESTIMMUNG
DER
LOESLICHKEIT
DES
REKOMBINANTEN
PROTEINS
.
36
3
4.1.3
PROTEINAUFREINIGUNG
MIT
EINER
NI-NTA-MATRIX
.
36
3.4.1
3
1.
PROTEINAUFREINIGUNG
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
36
3.4.1.3.2.
PROTEMAUFREINIGUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
37
3.4.2
EXPRESSION
EINES
REKOMBINANTEN
FUSIONSPROTEINS
IM
BACULOVIRALEN
SYSTEM
.
38
3.4.2
1.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
IN
SF9-ZELLEN
.
38
3.4.2
2.
EXPRESSION
IN
HIGH-FIVE-ZELLEN
UND
PROTEINAUFREINIGUNG
.
38
3.4.3.
MEMBRANPROTEIN-ISOLIERUNGAUS
EUKARYONTISCHEN
ZELLEN
.
.
.
39
3.4.4
DIALYSE
VON
PROTEINEN
.
39
3.4.5.
PROTEINKONZENTRATIONSBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
.
40
3.4.6.
IN
VITRO
TRANSKRIPTION
UND
TRANSLATION
(IVT)
.
40
3.5.
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
UND
SERUMGEWINNUNG.
40
3.6.
TECHNIKEN
ZUM
SPEZIFISCHEN
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
.
41
3.6.1
SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE
(SDS-PAGE)
.
41
3.6.1.1.
SDS-PAGE
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
41
3.6.1.2.
SDS-PAGE
UNTER
HALBDENATUNERENDEN
BEDINGUNGEN
.
43
3.6
1.3.
NACHWEIS
VON
PROTEINBANDEN
IM
POLYACRYLAMIDGEL
MITTELS
COOMASSIE-FAERBUNG
.
43
3.6.2.
IMMUNBLOT
(WESTERN
BLOT)
.
43
3
6.2.1
TRANSFER
.
43
3.6.2.2
IMMUNREAKTIONEN
.
44
3.6.3.
DURCHFLUSSZYTOMETRIE
(FACS-ANALYSE)
.
45
3.6
3.1.
AUFREINIGUNG
DER
CAR-SPEZIFISCHEN
SEREN
.
45
3.6.3.2.
SPEZIFISCHER
NACHWEIS
VON
ZELLOBERFLAECHENPROTEMEN
.
46
3.6.4.
IMMUNPRAEZIPITATION
.
47
3.6.4
1
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
ZELLEN
.
47
3
6.4.2.
IMMUNPRAEZIPITATION
RADIOAKTIV
MARKIERTER
PROTEINE
(DENATURIERENDE
BEDINGUNGEN)
.
48
3.6.4.3
IMMUNPRAEZIPITATION
UND
NACHWEIS
IM
IMMUNBLOT
.
48
3.6.4.3.1.
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
48
3.6.4.3
2.
UNTER
NICHT
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
49
3.6.5.
QUERVEMETZUNG
VON
ZELLOBERFLAECHENPROTEINEN
DURCH
EINEN
CHEMISCHEN
CROSSLINKER
.
49
I.
ERGEBNISSE.
51
4.1.
EXPRESSION
EINES
CAR-HIS-THG-FUSIONSPROTEINS
IM
BAKTERIELLEN
SYSTEM.
51
4
11.
KLONIERUNG
DES
BAKTERIELLEN
EXPRESSIONSVEKTORS
PQE-60-CAR
.
51
4.1.2.
EXPRESSION
DES
CAR-HIS-Z^G-FUSIONSPROTEMS
IN
ESCHERICHIA
COLI.
.
53
4
1.2.1.
ZEITVERLAUF
DER
EXPRESSION
DES
CAR-HIS-7AG-FUSIONSPROTEINS
NACH
INDUKTION
.
53
4
1.2.2.
ERMITTLUNG
DER
INDUKTIONSBEDINGUNGEN
FIIR
DIE
NATIVE
PROTEINEXPRESSION
.
54
INHALTSVERZEICHNIS
4.1.3.
AUFREINIGUNG
DES
CAR-HIS-TAG-FUSIONSPROTEINS
.
56
4.1.3.1
PROTEINAUFREINIGUNG
UNTER
DENATURIERENDEN
BEDINGUNGEN
.
56
4.1
3
2.
PROTEINAUFREINIGUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
57
4.2.
EXPRESSION
EINES
CAR-HIS-ZAG-FUSIONSPROTEINS
IM
BACULOVIRALEN
SYSTEM
.
59
4.2.1.
KLONIERUNG
DES
BACULOVIRALEN
TRANSFERPLASMIDS
PBAC3-CAR-HIS
.
60
4.2.2.
HERSTELLUNG
REKOMBINANTER
BACULOVIREN
.
61
4.2.3.
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DES
CAR-HIS-TAG-FUSIONSPROTEINS
IN
SF9-ZELLEN
.
63
4.2.4.
EXPRESSION
DES
CAR-HIS-TAG-FUSIONSPROTEINS
IN
7/JGAE-FZVE-ZELLEN
UND
PROTEINAUFREINIGUNG
UNTER
NATIVEN
BEDINGUNGEN
.
64
4.3.
UNTERSUCHUNG
DER
VIRUSBINDUNG
DURCH
REKOMBINANTE
CAR-HIS-TAG-FUSIONSPROTEINE
.
65
4.3.1.
NACHWEIS
DER
WECHSELWIRKUNG
VON
CVB3
MIT
DEM
BAKTERIELL
EXPRIMIERTEN
CAR-HIS-7AG-FUSIONSPROTEIN
IM
VOPBA
.
66
4.3.2.
UNTERSUCHUNG
DER
INFEKTIONSINHIBITION
DURCH
CAR-HIS-TAG-FUSIONSPROTEINE
.
68
4.4.
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
POLYKLONALER,
CAR-SPEZIFISCHER
ANTISEREN
.
70
4.4.1
IMMUNISIERUNG
VON
KANINCHEN
.
70
4.4.2.
NACHWEIS
VON
CAR
IM
IMMUNBLOT
.
72
4.4.3.
UNTERSUCHUNG
DER
ANTIKOERPER-VERMITTELTEN
INFEKTIONSINHIBITION
.
75
4.4.4.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHER
NACHWEIS
VON
CAR.
.
75
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
1
.
77
4.5.
HERSTELLUNG
UND
CHARAKTERISIERUNG
EINER
REZEPTOR-TRANSFIZIERTEN
ZELLLINIE
.
78
4.5
1.
STABILE
TRANSFEKTION
VON
CHODAF-ZELLEN
MIT
EINEM
CAR-EXPRESSIONSPLASMID
.
78
4.5.2.
IDENTIFIZIERUNG
CAR-POSITIVER
KLONE
DURCH
INFEKTION
MIT
CVB3
.
79
4.5.3.
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE
ANALYSE
DER
REZEPTOREXPRESSION
.
79
4.5.4.
ANALYSE
DER
CAR-EXPRESSION
DER
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
IM
IMMUNBLOT
.
80
4.6.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
INFEKTION
REZEPTOR-POSITIVER
ZELLLINIEN
DURCH
CVB3-VARIANTEN
.
82
4.6.1,
VIRUSBINDUNG
AN
REZEPTOR-TRANSFIZIERTE
ZELLEN
.
82
4.6.2.
BESTIMMUNG
RELATIVER
ZYTOPATHISCHER
EFFEKTE
BEI
CVB3-INFEKTION
.
84
4.6.3.
UNTERSUCHUNG
DER
PLAQUE-MORPHOLOGIE
REZEPTOR-TRANSFIZIERTER
ZELLEN
.
85
4.6.4.
ZEITVERLAUF
DES
VIRALEN
WACHSTUMS
.
86
4.7.
UNTERSUCHUNGEN
ZUM
POTENZIELLEN
CVB3-REZEPTORKOMPLEX
AUS
CAR
UND
DAF.
88
4.7.1.
ANTIKOERPER-VERMITTELTE
INHIBITION
DER
CVB3-INFEKTION
.
89
4.7.2.
REZEPTORINTEMALISIERUNG
IM
VERLAUF
DER
CVB3-INFEKTION
.
90
4.7
3.
IMMUNPRAEZIPITATION
DER
CVB3-REZEPTORPROTEINE
CAR
UND
DAF
.
93
4.7
3
1.
IMMUNPRAEZIPITATION
UND
AUTORADIOGRAPHISCHER
NACHWEIS
.
94
4.7.3.2.
IMMUNPRAEZIPITATION
UND
NACHWEIS
IM
IMMUNBLOT
.
95
4.7.3.2
1
DENATURIERENDE
IMMUNPRAEZIPITATION
UND
NACHWEIS
IM
TMMUNBLOT
.
95
4.7
3.2.2
NICHT
DENATURIERENDE
IMMUNPRAEZIPITATION
UND
NACHWEIS
IM
IMMUNBLOT
.
96
4
7.4.
QUERVEMETZUNG
VON
ZELLOBERFLAECHENPROTEINEN
DURCH
EINEN
CHEMISCHEN
CROSSHNKER
.
98
ZUSAMMENFASSUNG
DER
ERGEBNISSE
II
.
101
INHALTSVERZEICHNIS
5.
DISKUSSION
.
102
5.1.
HINTERGRUND
UND
FRAGESTELLUNG
DER
ARBEIT
.
102
5.2.
FUNKTIONALITAET
REKOMBINANTER
CAR-HIS-TAG-FUSIONSPROTEINE.
103
5.3.
BEDEUTUNG
DER
REZEPTOREXPRESSION
FUER
VIRUSBINDUNG
UND
INFEKTION.
106
5.4.
EXISTIERT
EIN
CVB3-REZEPTORKOMPLEX
AUS
CAR
UND
DAF?
.
112
5.5.
SCHLUSSFOLGERUNGEN
.
116
6.
ZUSAMMENFASSUNG
.
117
7.
LITERATUR.
118
8.
VERZEICHNIS
DER
VERWENDETEN
ABKUERZUNGEN
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