Molekularbiologische und biochemische Charakterisierung der Lantibiotika-Biosyntheseenzyme EpiD und MrsD:
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Tübingen, Weißdornweg 14/141
<<F.>> Majer
2002
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| adam_text | ~ ~» A 3 - MOLEKULARBIOLOGISCHE UND BIOCHEMISCHE CHARAKTERISIERUNG DER
LANTIBIOTIKA- BIOSYNTHESEENZYME EPID UND MRSD DISSERTATION ZUR ERLANGUNG
DES GRADES EINES DOKTORS DER NATURWISSENSCHAFTEN DER FAKULTAET FUER
BIOLOGIE DER EBERHARD-KARLS-UNIVERSITAET TUEBINGEN VORGELEGT VON FLORIAN
MAJER AUS GIFHORN 2002 A EINLEITUNG 7 1 LANTIBIOTIKA 7 1.1
WIRKMECHANISMUS DER LANTIBIOTIKA 10 1.1.1 WIRKMECHANISMUS DER TYP A
LANTIBIOTIKA 10 1.1.1 WIRKMECHANISMUS DER TYP B LANTIBIOTIKA 12 1.2
BIOSYNTHESE DER LANTIBIOTIKA 12 1.2.1 EPIDERMIN-BIOSYNTHESE 13 1.2.2
MERSACIDIN-BIOSYNTHESE 14 2 DAS FLAVOENZYM EPID 15 2.1.1 ORGANISATION
UND AUFBAU DES EPID 17 3 DAS FLAVOENZYM MRSD 17 4 HFCD-PROTEINE 18 4.1
WC-DECARBOXYLASEN 20 5 ZIELSETZUNG 22 B MATERIAL UND METHODEN 23 1
MATERIAL 23 1.1 CHEMIKALIEN 23 1.2 SPEZIELLE LABORGERAETE 24 1.3 PLASMIDE
25 1.4 BAKTERIENSTAEMME 26 1.5 ENZYME 26 1.6 ALLGEMEINE NAEHRMEDIEN 27 1.7
MEDIUMZUSAETZE 27 1.8 SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 28 1.9 ANTISERENUND
ANTIKOERPER 32 1.9.1 ANTI-MRSD-ANTIKOERPER 32 2 MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN 33 2.1 ISOLIERUNG VON PLASMID-DNA AUS E. COLI 33 2.2
AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE VON DNA-FRAGMENTEN 33 1.3 ISOLIERUNG VON
DNA-FRAGMENTEN AUS AGAROSEGELEN 34 2.4 KONSTRUKTION VON PLASMIDEN ZUR
EXPRESSION VON EPID* UND MRSD* 34 2.4.1 LIGATION VON EPID* ODERMRSD*
INPQE12 34 2.4.2 KONSTRUKTION DES EXPRESIONSVEKTORS PQES-EPIA-EPIT) 35
2.4.3 KONSTRUKTION DES EXPRESSIONSVEKTORS PQE8MA 36 2.5 TRANSFORMATION
VON E.CO/I-ZELLEN 36 2.6 POLYMERASE-KETTENREAKTION 37 2.7
OLIGONUKLEOTID-DIRIGIERTE MUTAGESE MITTELS PCR 37 2.8 SEQUENZIERUNG VON
DNA 39 2.8.1 SEQUENZIERUNG MIT DEM LI-COR-DNA-SEQUENZER 40 3
PROTEINCHEMISCHE, IMMUNOLOGISCHE UND ANALYTISCHE METHODEN 40 3.1
PROTEINEXPRESSION IN E. COFT-ZELLEN ...40 3.2 ZELLAUFSCHLUSS UND
ZELLLFRAKTIONIERUNG 41 3.3 PROTEIN-UND PEPTIDREINIGUNG 41 3.3.1
REINIGUNG VON MBP-FUSIONSPROTEINEN DURCH AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 42
3.3.2 NICKEL-AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE 42 3.3.2.1 PRINZIP DES
HIS-TAG-SYSTEMS 42 3.3.2.2 PROTEINREINIGUNG UEBER IMAC MIT NI-NTA-HARZ 43
3.4 PROTEINBESTIMMUNG 44 3.5 TRICINE-SDS-PAGE 44 3.5.1 PROTEINSTANDARDS
.....46 3.6 IMMUNOBLOT-ANALYSE 47 3.7 KOEXPRESSION UND IMMUNOBLOTANALYSE
VON HIVEPIA UND EPID 48 3.8 GEKOPPELTER DECARBOXYLASE-TEST 49 C
ERGEBNISSE 51 1 CHARAKTERISIERUNG VON EPID* 51 1.1 AUSWAHL
FUNKTIONSRELEVANTER AMINOSAEURERESTE IM EPID 51 1.2 KONSTRUKTION UND
REINIGUNG VON EPID* 52 1.2.1 AUFREINIGUNG VON EPID* 53 1.2.2
AUFREINIGUNG VON EPID* UEBER ZWEI AA-CHROMATOGRAPHIEN UND GELFILTRATION
56 1.3 GELFILTRATIONSEXPERIMENTE UND MULTIMERSTRUKTUR 61 1.4
UNTERSUCHUNG VON EPID* IM UV-VIS-SPEKTROMETER 63 2 AKTIVITAET VON EPID*
64 2.1 GEKOPPELTER DECARBOXYLASE-TEST 73 3 UNTERSUCHUNG DER REOXIDATION
VON EPID* 74 4 KOEXPRESSION VON HIS-EPIA UND EPID 76 5
SUBSTRATSPEZIFITAET VON EPID* MIT SYNTHETISCHEN PEPTIDBIBLIOTHEKEN 80 6
CHARAKTERISIERUNG VON MRSD 91 6.1 ERZEUGUNG UND REINIGUNG VON MUTIERTEM
MBP-MRSD 91 OE.2 UV-VIS-SPEKTRUM VON MBP-MRSD* 92 6.3 ERZEUGUNG UND
REINIGUNG VON MRSD* 93 7 UNTERSUCHUNG DER MRSD-AK TIVITAET 97 7.1
REINIGUNG DES PEPTIDS HIS 6 -MRSA 99 7.2 AKTIVITAET VON MRSD MIT DEN
PEPTIDSUBSTRAT MRSA 102 7.3 AKTIVITAET VON MRSD MIT DEM PEPTIDSUBSTRAT
HIS6-MRSA 105 7.4 SUBSTRATSPEZIFITAET VON MRSD UND EPID 107 7.5
MASSENSPEKTROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG DER MRSD-AKTIVITAET 108 D DISKUSSION
111 1 REINIGUNG UND CHARAKTERISIERUNG VON EPID-MUTANTEN 111 2
UNTERSUCHUNGEN ZUR MULTIMERSTRUKTUR VON EPID* 112 3 AMINOSAEURERESTE
BETEILIGT AN DER COENZYMBINDUNG 113 3.1 UNTERSUCHUNG DES TASI-MOTIVS 114
4 SUBSTRATBINDUNG IM EPID 116 4.1 AMINOTERMINALESUBSTRATBINDEHELIX 117
4.2 NHI-MOTIV 119 4.3 SUBSTRATBINDEKLAMMER 119 5 AMINOSAEURERESTE AM
AKTIVEN ZENTRUM VON EPID 121 6 SUBSTRATBINDUNG UND AKTIVITAET 123 7
NACHWEIS DER AKTIVITAET VON MRSD 124 7.1 AKTIVITAET VON MRSD* 125 8
SUBSTRATSPEZIFITAET VON EPID UND MRSD 126 9 VERGLEICH MIT
CHARAKTERISIERTEN HFCD-PROTEINEN 128 9.1 * SUBSTRATBINDUNG UND
REAKTIONSMECHANISMUS DER PPC-DECARBOXYLASEN 129 10 AUSBLICK 131 E
ZUSAMMENFASSUNG 132 F LITERATUR 134
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