Konditionale ubiquitäre Expression des Homöoboxgens goosecoid im Primitivstreifen der Maus:
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Karlsruhe
Forschungszentrum Karlsruhe
2002
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| Series: | Wissenschaftliche Berichte / Forschungszentrum Karlsruhe Technik und Umwelt
6775 |
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INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG
.
I
ABSTRACT
.
II
INHALTSVERZEICHNIS
.
M
ABKUERZUNGEN
.
VII
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
GASTRULATION
.
1
1.2
DIE
ENTSTEHUNG
DER
KOERPERACHSEN
.
2
1.2.1
DER
SPEMANN
ORGANISATOR
.
3
1.2.2
EIGENSCHAFTEN
DES
ORGANISATORS
.
4
1.3
GASTRULATION
BEI
DER
MAUS
.
5
1.3.1
REGIONALISIERUNG
DES
MESODERMS
IM
PRIMITIVSTREIFEN
.
7
1.3.2
DER
PRIMITIVKNOTEN
.
9
1.3.3
DER
PRIMITIVKNOTEN
BESITZT
DIE
EIGENSCHAFTEN
DES
SPEMANN'SCHEN
ORGANISATORS
.
10
1.3.4
ZELLBEWEGUNGEN
IM
PRIMITIVSTREIFEN
.
11
1.3.5
ZELLMIGRATION
IM
MESODERM
.
12
1.4
DAS
ORGANISATORPRINZIP
.
14
1.4.1
DIE
BMP-4
INTERAKTION
.
15
1.4.2
DIE
WNT
INTERAKTION
.
17
1.5
DER
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
GOOSECOID
REGULIERT
EIN
ORGANISATORSPEZIFISCHES
GENPROGRAMM
.
19
1.6
EXPRESSION
DES
GOOSECOID-GENS
IN
DER
MAUS
.
21
1.7
GOOSECOID
KNOCK-OUT
MUTATION
DER
MAUS
.
22
1.8
ZIEL
DER
ARBEIT:
ANALYSE
DER
REGIONALISIERUNG
DURCH
EINE
MISS
EXPRESSION
DES
GOOSECOID-GENS
IN
DER
MAUS
.
23
1.8.1
EIN
PROMOTORELEMENT
DES
BRACHYURY-GENS
KONTROLLIERT
DIE
MISSEXPRESSION
DES
GOOSECOID-GENS
IN
DER
MAUS
.
24
1.8.2
EXPERIMENTELLES
SYSTEM
ZUR
MISSEXPRESSION
DES
GOOSECOID
GENS
IN
DER
MAUS:
TRANSGENE
MAEUSE
.
24
1.8.3
MISSEXPRESSION
DES
GOOSECOID-GENS
IN
DER
MAUS
DURCH
KONDITIONALE
MUTAGENESE
1.9
ARBEITSHYPOTHESE
-
SPEZIFISCHE
FRAGESTELLUNG
.
29
2
ERGEBNISSE
.
31
2.1
CHARAKTERISIERUNG
UND
EXPRESSION
DES
TRANSGENKONSTRUKTS
.
31
2.2
KONDITIONALE
AKTIVIERUNG
DES
TRANSGENS
IN
VITRO
.
35
2.3
REPRESSION
DER
BRACHYU/Y-EXPRESSION
DURCH
DAS
GENPRODUKT
DES
TRANSGENS
.
37
2.4
HERSTELLUNG VON
TRANSGENEN
MAEUSEN
MIT
STABILER
INTEGRATION
DES
TRANSGENS
.
40
2.4.1
BLASTOZYSTENINJEKTION
.
40
2.4.2
INTEGRATION
DER
TRANSGENEN
ES-ZELLKLONE
IN
DIE
KEIMBAHN
.
41
2.4.3
GENOTYPISIERUNG
DER
TRANSGENEN
TIERE
.
44
2.5
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DES
TRANSGENS
IN
EMBRYONEN
.
46
2.5.1
ANALYSE
DER
LACZ-MARKERGENEXPRESSION
IN
TRANSGENEN
EMBRYONEN
.
46
2.5.2
ANALYSE
DER
EXPRESSION
DES
GOOSECO/D-TRANSGENS
IN
DOPPELT
TRANSGENEN
EMBRYONEN
.
49
2.5.2.1
AKTIVIERUNG
DES
GOOSECO/D-TRANSGENS
IN
VIVO
.
49
2.5.2.2
EXPRESSION
DES
GOOSECO/D-TRANSGENS
IN
DOPPELT
TRANSGENEN
EMBRYONEN
.
51
2.6
ANALYSE
DES
PHAENOTYPS
BEI
EXPRESSION
DES
GOOSECO/D-TRANSGENS
.
53
2.6.1
UNVOLLSTAENDIGES
AUFTRETEN
DES
NTD-PHAENOTYPS
.
55
2.6.2
DOPPELT
TRANSGENE
EMBRYONEN
EXPRIMIERTEN
ZWEI
TRANSGENE
GOOSECO/D-TRANSKRIPTE
.
56
2.7.1
ANALYSE
VON
WECHSELWIRKUNGEN
MIT
ANDEREN
EMBRYONALEN
MARKER
GENEN
IN
DOPPELT
TRANSGENEN
EMBRYONEN
.
60
2.7.1
REPRESSION
DER
ENDOGENEN
BRAC/IYURY-TRANSKRIPTE
IN
DOPPELT
TRANSGENEN
EMBRYONEN
.
60
2.7.2
ERHOEHTE
EXPRESSION
DES
HNF-3SS-GENS
IN
DOPPELT
TRANSGENEN
EMBRYONEN
.
62
2.7.3
DIE
FGF-8-GENEXPRESSION
IST
IN
GOOSECOID
MISS
EXPRIMIERENDEN
EMBRYONEN
ERHOEHT
.
63
2.8
GENERALISIERTE
UEBEREXPRESSION
EINES
GOOSECO/D-TRANSGENS
IN
CHIMAEREN
EMBRYONEN
.
64
IV
3
DISKUSSION
.
69
3.1
EXPRESSIONSMUSTER
DES
ENDOGENEN
UND
TRANSGENEN
GOOSECOID-GENS
.
70
3.1.1
DOPPELT
TRANSGENE
EMBRYONEN
EXPRIMIERTEN
ZWEI
TRANSGENE
GOOSECOID
T
RANSKRIPTE
.
76
3.2
EINFLUSS
DER
EXPRESSSION
DES
GOOSECO/D-TRANSGENS
AUF
ANDERE
EMBRYONALE
REGULATIONSGENE
3.2.1
REPRESSION
DER
ENDOGENEN
BRACHYURY
TRANSKRIPTION
.
77
3.2.2
VERSTAERKUNG
DER
ENDOGENEN
/-/NF-3SS-EXPRESSION
.
81
3.2.3
WEITERE
EMBRYONALE
MARKERGENE
FUER
DIE
ANALYSE
DER
VERAENDERTEN
MUSTERBILDUNG
IM
ANTERIOREN
ZNS
.
83
3.3
PHAENOTYPISCHE
VERAENDERUNGEN
DURCH
DIE
GOOSECOID
MISSEXPRESSION
.
85
3.3.1
ENTSTEHUNG
UND
VERSCHLUSS
DES
NEURALROHRES
.
86
3.3.2
FEHLENTWICKLUNG
DES
NEURALROHRVERSCHLUSSES
.
89
3.3.3
NEURALROHRDEFEKTE
IN
VERSCHIEDENEN
MAUSMUTANTEN
.
90
3.3.4
NEURALROHRDEFEKTE
IN
GOOSECOID
MISSEXPRIMIERENDEN
EMBRYONEN
.
94
3.3.5
HAEUFIGKEIT
DES
NTD-PHAENOTYPS
IN
GOOSECOID
MISSEXPRIMIERENDEN
EMBRYONEN
.
95
3.3.6
SPEZIFITAET
DES
NTD-PHAENOTYPS
IN
GOOSECOID
MISSEXPRIMIERENDEN
EMBRYONEN
.
99
3.3.7
GOOSECOID
MISEXPRESSION
UND
NEURALROHRDEFEKTE:
EIN
MODELL
.
101
4
MATERIAL
.
105
4.1
BEZUGSQUELLEN
.
105
4.2
BAKTERIENSTAEMME
UND
EUKARYONTISCHE
ZELLINIEN
.
109
4.3
KULTURMEDIEN
.
109
4.4
PUFFER
UND
LOESUNGEN
.
110
4.5
PLASMIDE
.
111
4.6
MAUSSTAEMME
UND
MAUSLINIEN
.
112
5
METHODEN
.
113
5.1
REINIGUNG
UND
KONZENTRATION VON
NUKLEINSAEUREN
.
113
5.2
PRAEPARATION
VON
DNA
.
113
5.3
KLONIERUNGSTECHNIKEN
.
115
5.4
ELEKTROPHORETISCHE
AUFTRENNUNG
VON
NUKLEINSAEUREN
UEBER
AGAROSEGELE
.
117
5.5
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA-FRAGMENTEN
AUS
AGAROSEGELE
.
117
5.6
SEQUENZIERUNG
VON
PLASMID-DNA
UND
AUFTRENNUNG
DER
REAKTIONSPRODUKTE
.
118
5.7
PRAEPARATION
VON
POLYADENYLIERTER
RNA
.
119
5.8
DAS
T
RANSGENKONSTRUKT
.
120
5.9
ZELLKULTUR
.
122
5.10
HERSTELLUNG
TRANSGENER
MAEUSE
.
127
5.11
VERPAAREN
DER
MAEUSE
UND
BESTIMMUNG
DER
EMBRYONALEN
ENTWICKLUNGSSTADIEN
.
128
5.12
ISOLIERUNG
UND
FIXIERUNG
VON
EMBRYONEN
.
129
5.13
ANALYTISCHE
METHODEN
.
129
5.13.1
SOUTHERN
BLOT
ANALYSE
.
129
5.13.2
POLYMERASEN
KETTENREAKTION
.
130
5.13.3
DAS
ANFERTIGEN
VON
HISTOLOGISCHEN
SCHNITTEN
.
133
5.13.4
IN
SITU
HYBRIDISIERUNG
IM
GANZPAEPARAT
.
134
5.13.5
BESTIMMUNG
DER
LUZIFERASE-AKTIVITAET
.
136
5.13.6
NACHWEIS
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVTAET
MIT
DEM
SUBSTRAT
X-GAL
IM
GANZPRAEPARAT
UND
IN
ES-ZELLEN
.
137
6
LITERATUR
.
139
VI |
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