Mitochondriale Biogenese: Komponenten und Mechanismen der Proteinsortierung in die Matrix und Innenmembran der Mitochondrien
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2002
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INHALTVERZLCHNLI
1
EINLEITUNG
.
1
1.1
AUFBAU
UND
FUNKTIONSWEISE
DER
MITOCHONDRIEN
.
2
1.2
MITOCHONDRIALE
PROTEINE
.
3
1.3
PROTEINTRANSPORT
IN
MITOCHONDRIEN
.
4
1.3.1
MITOCHONDRIALE
IMPORTSIGNALE
.
5
1.3.2
DER
IMPORT
IN
DIE
MITOCHONDRIALE
MATRIX
.
7
1.3.3
DER
IMPORT
IN
DIE
INNENMEMBRAN
VON
MITOCHONDRIEN
.
10
1.4
MEMBRANINSERTION
UND
ORIENTIERUNG
VON
MEMBRANPROTEINEN
.
13
1.5
MOLEKULARE
CHAPERONE
IN
MITOCHONDRIEN
.
14
1.6
FRAGESTELLUNG
UND
ZIELSETZUNG
.
17
2
MATERIAL
UND
METHODEN
.
18
2.1
MOLEKULARBIOLOGISCHE
METHODEN
.
18
2.1.1
VERWENDETE
STAEMME
VON
E.
COLI
.
18
2.1.2
VERWENDETE
PLASMIDE
.
18
2.1.3
PLASMIDREINIGUNG
.
19
2.1.4
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
DNS
.
20
2.1.5
AMPLIFIZIEREN
VON
DNS-FRAGMENTEN
MITTELS
YYPOLYMERASE-KETTENREAKTION
"
.
20
2.1.6
KLONIERUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
21
2.1.6.1
RESTRIKTIONSVERDAU
.
21
2.1.6.2
DEPHOSPHORYLIERUNG
VON
DNS
.
21
2.1.6.3
AUFFUELLUNG
VON
5
'-UEBERSTEHENDEN
ENDEN
.
22
2.1.6.4
LIGATION
.
22
2.1.6.5
ELEKTROPHORESE
ZUR
AUFTRENNUNG
VON
DNS-FRAGMENTEN
.
22
2.1.6.6
ELUTION
VON
DNS
AUS
AGAROSE
MIT
HILFE
EINES
GELEXTRAKTIONS-KITS
.
23
2.1.7
HERSTELLUNG
ELEKTROKOMPETENTER
E.
CO/I-BAKTERIEN
.
23
2.1.8
HERSTELLUNG
CHEMISCH
KOMPETENTER
.
COZI-BAKTERIEN
.
23
2.1.9
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/I-BAKTERIEN
MITTELS
ELEKTROPORATION
.
24
2.1.10
TRANSFORMATION
VON
E.
CO/I-BAKTERIEN
MITTELS
CACLI
.
24
2.1.11
KLONIERUNGSSTRATEGIEN.
.
25
2.2
HEFEGENETISCHE
METHODEN
.
29
2.2.1
VERWENDETE
STAEMME
VON
S.
CEREVISIAE
.
29
2.2.2
KULTIVIERUNG
VON
S
CEREVISIAE
.
31
2.2.3
HERSTELLUNG
TRANSFORMATIONSKOMPETENTER
S.
CEREVISIAE-ZEUEEN
.
32
2.2.4
TRANSFORMATION
VON
S.
CEREVISIAE
MITTELS
LI-ACETAT-METHODE
.
32
2.2.5
NACHWEIS
VON
MUTATIONEN
IM
GENOM
VON
&
CEREVISIAE
.
33
2.3
PROTEINCHEMISCHE
METHODEN
.
33
2.3.1
FAELLUNG
VON
PROTEINEN
MIT
TRICHLORESSIGSAEURE
(TCA)
.
33
2.3.2
SDS-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE
.
34
2.3.3
COOMASSIEFAERBUNG
VON
GELEN
.
34
2.3.4
AUTORADIOGRAPHIE
UND
DENSITOMETRIE
.
34
2.3.5
TRANSFER
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
.
35
2.3.6
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
VON
PROTEINEN
NACH
BRADFORD
.
35
2.3.7
SYNTHESE
MITOCHONDRIALER
VORLAEUFERPROTEINE
IN
VITRO
.
35
2.3.7.1
TRANSKRIPTION
.
36
2.3.7.2
TRANSLATION
IN
RETIKULOZYTENLYSAT
.
36
2.3.7.3
SYNTHESE
VON
VORSTUFENPROTEINEN
MIT
TNTO-LYSAT-KIT
.
36
2.3.8
NI-NTA-AFFINITAETSAUFREINIGUNG
VON
LOESLICHEN
MITOCHONDRIALEN
PROTEINKOMPLEXEN
.
.
37
2.3.9
BESTIMMUNG
DES
FALTUNGSZUSTANDES
MITOCHONDRIAL
LOKALISIERTER
PROTEINE
.
38
11
INHALTSVERZEICHNIS
2.3.9.1
FALTUNGSTEST
FUER
DHFR
DER
MAUS
.
38
2.3.9.2
AGGREGATIONSTEST
FUER
VARL
.
38
2.4
ZELLBIOLOGISCHE
METHODEN
.
39
2.4.1
GEWINNUNG
VON
GESAMTZELLPROTEIN
AUS
HEFE
.
39
2.4.2
ANZUCHT
VON
S.
CEREVISIAE
ZUR
ISOLATION
VON
MITOCHONDRIEN
.
39
2.4.3
SUBFRAKTIONIERUNG
VON
HEFEZELLEN
.
40
2.4.4
ISOLIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
AUS
S
CEREVISIAE
.
40
2.4.5
SUBFRAKTIONIERUNG
VON
MITOCHONDRIEN
.
41
2.4.6
IMPORT
VON
PROTEINEN
AUS
RETIKULOZYTENLYSAT
.
42
2.4.7
MITOCHONDRIALE
SUBLOKALISATION
VON
IN
VITRO
IMPORTIERTEN
PROTEINEN
.
42
2.4.7.1
NACHBEHANDLUNG
VON
MITOCHONDRIEN
MIT
PROTEASE
.
42
2.4.7.2
HERSTELLUNG
VON
MITOPLASTEN
DURCH
OSMOTISCHEN
SCHOCK
.
43
2.4.8
HERSTELLUNG
VON
TRANSLOKATIONSINTENNEDIATEN
MIT
METHOTREXAT
.
43
2.4.9
SENKUNG
DER
ATP-KONZENTRATION
IN
DER
MITOCHONDRIALEN
MATRIX
.
43
2.4.10
BESTIMMUNG
DES
MEMBRANPOTENTIALS
IN
ISOLIERTEN
MITOCHONDRIEN
.
44
2.4.11
MARKIERUNG
MITOCHONDRIALER
TRANSLATIONSPRODUKTE
IN
ISOLIERTEN
MITOCHONDRIEN
.
(IN
ORGANELLO
TRANSLATION)
.
44
2.5
IMMUNOLOGISCHE
METHODEN
.
45
2.5.1
KOPPLUNG
SYNTHETISCHER
PEPTIDE
AN
OVALBUMIN
.
45
2.5.2
ERZEUGUNG
POLYKLONALER
ANTISEREN
.
45
2.5.3
IMMUNOLOGISCHER
NACHWEIS
VON
PROTEINEN
AUF
NITROZELLULOSEMEMBRANEN
(YYWESTERN
BLOT
"
)
.
46
2.6
CHEMIKALIEN
UND
ENZYME
.
46
2.7
GERAETE
UND
SONSTIGE
MATERIALIEN
.
48
3
ERGEBNISSE
.
49
3.1
ECML
0
IST
EIN
NEUES
MITGLIED
DER
FAMILIE
DER
MITOCHONDRIALEN
HSP70-PROTEINE
.
49
3.1.1
ECMLO
IST
EIN
LOESLICHES
PROTEIN
DER
MITOCHONDRIALEN
MATRIX
.
50
3.1.2
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
ECMLO
.
52
3.1.2.1
MUTATIONEN
IN
SSC1
UND
ECM10
FUEHREN
ZU
SYNTHETISCHEN
WACHSTUMSDEFEKTEN.
52
3.1.3
FUNKTIONELLE
CHARAKTERISIERUNG
VON
ECMLO
.
54
3.1.3.1
ECMLO
KANN
SSCL
IN
VIVO
NICHT
ERSETZEN
.
54
3.1.3.2
ECMLO
KANN
SSCL
BEIM
IMPORT
VON
PROTEINEN
IN
DIE
MITOCHONDRIALE
MATRIX
ERSETZEN
.
57
3.1.3.3
ECMLO
VERHINDERT
NICHT
DIE
AGGREGATION
VON
SSCL-3
.
60
3.1.3.4
ECMLO
BINDET
AN
IMPORTINTERMEDIATE
.
61
3.1.3.5
ECMLO
BINDET
EFFIZIENT
AN
MGEL
,
JEDOCH
NUR
SCHWACH
AN
TIM44
.
62
3.1.3.6
ECMLO
KANN
DIE
FALTUNGSAKTIVITAET
VON
SSCL
NUR
UNVOLLSTAENDIG
ERSETZEN
.
65
3.2
INSERTION
BITOPER
MEMBRANPROTEINE
.
69
3.2.1
SORTIERUNG
VON
MRS2
.
69
3.2.1.1
MRS2
ENTHAELT
ZWEI
UNABHAENGIGE
IMPORTSIGNALE
.
71
3.2.1.2
DAS
INTERNE
IMPORTSIGNAL
WIRD
NICHT
ZUR
SORTIERUNG
VON
MRS2
BENOETIGT
.
74
3.2.1.3
MRS2
BILDET
EIN
LOESLICHES
SORTIERUNGSINTERMEDIAT
.
76
3.2.1.4
DIE
MEMBRANINSERTION
VON
MRS2
IST
UNABHAENGIG
VON
OXAL
UND
MBAL
.
78
3.2.2
SORTIERUNG
VON
YTAL
0
.
80
3.2.2.1
YTAL
0
BILDET
EINE
IN
DER
MITOCHONDRIALEN
MATRIX
LOKALISIERTE
SORTIERUNGSZWISCHENSTUFE
.
81
3.2.2.2
DIE
BEDEUTUNG
VON
OXAL
FUER
DIE
INSERTION
VON
YTALO
IN
DIE
INNENMEMBRAN
.
.
83
3.2.2.3
DIE
INSERTION
VON
YTAL
0
IST
ABHAENGIG
VOM
MEMBRANPOTENTIAL
ATG
.
86
INHALTAVERZELCHNLA
III
4
DISKUSSION
.
88
4.1
PROTEINFALTUNG
UND
CHAPERONE
.
88
4.1.1
ECMLO
ALS
MITGLIED
DER
HSP70-FAMILIE
.
88
4.1.2
STRUKTURELLER
VERGLEICH
ZWISCHEN
ECMLO
UND
SSCL
.
90
4.1.3
FUNKTIONELLER
VERGLEICH
ZWISCHEN
ECMLO
UND
SSCL
.
92
4.1.4
AUSBLICK
.
95
4.2
SORTIERUNG
POLYTOPER
INNENMEMBRANPROTEINE
.
96
4.2.1
DER
KONSERVATIVE
SORTIERUNGSWEG
BITOPER
INNENMEMBRANPROTEINE
.
96
4.2.2
WELCHE
KOMPONENTEN
VERMITTELN
DIE
TRANSLOKATION
VON
INTERMEMBRANRAUMDOMAENEN?
.
97
4.2.3
WOHER
KOMMT
DIE
ENERGIE
FUER
DIE
INSERTION?
.
99
4.2.4
GIBT
ES
EIN
ALLGEMEINES
PRINZIP
FUER
DIE
INSERTION
VON
INNENMEMBRANPROTEINEN?
100
4.2.5
FAZIT
UND
AUSBLICK
.
102
5
ZUSAMMENFASSUNG
.
104
6
LITERATUR
.
105 |
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| title_sub | Komponenten und Mechanismen der Proteinsortierung in die Matrix und Innenmembran der Mitochondrien |
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| topic_facet | Hochschulschrift Biogenese Mitochondrium |
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