Gezielte Reaktivierung spezifischer zytotoxischer T-Zellen mit Epstein-Barr-Virus-Vektoren:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG 1
1.1 SPEZIFISCHE IMMUNITAET 1
1.2 ANTIGENE UND ANTIGENPRAESENTATION * 2
1.3 PROFESSIONELLE ANTIGENPRAESENTIERENDE ZELLEN 3
1.4 HERPESVIREN 4
1.5 DAS EPSTEIN-BARR-VIRUS 4
1.6 EBV-ASSOZIIERTE TRANSFORMATION IN VIVO: TUMORERKRANKUNGEN 5
1.7 TRANSFORMATION DURCH EBV IN VITRO 6
1.8 IMMUNITAET GEGENUEBER EBV ~ 7
1.9 DAS HUMANE CYTOMEGALOVIRUS 9
1.10 IMMUNITAET GEGENUEBER CMV 11
1.11 ANTIVIRALE THERAPIE MIT SPEZIFISCHEN T-ZELLEN 12
1.12 MINI-EBV-PLASMIDE UND EBV-VEKTOREN 13
1.13 SCHLUSSFOLGERUNG UND ZIELSETZUNG 17
2 MATERIAL UND METHODEN 18
2.1 MATERIAL 18
2.1.1 BAKTERIENSTAEMME 18
2.1.2 ZELLINIEN 18
2.1.3 VIREN 19
2.1.4 PLASMIDE 19
2.1.5 ANTIKOERPER 20
2.1.6 HLA/PEPTID-TETRAMERE 21
2.1.7 SONSTIGE REAGENZIEN 21
2.1.8 VERBRAUCHSMATERIALIEN 22
2.1.9 GERAETE 22
2.1.10 DIENSTLEISTUNGEN 23
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
2.2 ARBEITEN MIT DNA UND PROTEINEN 23
2.3 ARBEITEN MIT BAKTERIEN 24
2.3.1 BAKTERIENKULTUR 24
2.3.2 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 24
2.4 ARBEITEN MIT EUKARYONTEN ZELLEN 25
2.4.1 KULTIVIERUNG PERMANENTER ZELLINIEN ' 25
2.4.2 ISOLIERUNG PRIMAERER HUMANER LYMPHOZYTEN 27
2.4.3 GENERIERUNG VON MINI-EBV-VIRIONEN 27
2.4.4 INFEKTION VON B-ZELLEN MIT EBV ODER EBV-VEKTOREN 28
2.4.5 PCR-ANALYSE VON MINI-LCLS 29
2.4.6 GENERIERUNG POLYKLONALER T-ZELLINIEN _ 29
2.4.7 FACS-ANALYSEN 30
2.4.8 INTERFERON-Y-SEKRETIONSANALYSE 31
2.4.9 TETRAMER-ANALYSEN 31
2.4.10 ZYTOTOXIZITAETS-ANALYSEN 32
2.5 ARBEITEN MIT VIREN 33
2.5.1 EPSTEIN-BARR-VIRUS 33
2.5.2 CYTOMEGALOVIRUS 34
2.5.3 REKOMBINANTE VACCINIAVIREN 34
3 ERGEBNISSE 36
3.1 KONSTRUKTION VON MINI-EBV-PLASMIDEN 37
3.1.1 EINBAU EINES FREMDGENS IN EIN MINI-EBV-PLASMID 37
3.1.2 KONSTRUKTION VON HPV-MINI-EBV-PLASMIDEN 40
3.1.3 KONSTRUKTION EINES EPCAM-MINI-EBV-PLASMIDS 42
3.1.4 KONSTRUKTION EINES PP65-MINI-EBV-PLASMIDS 44
3.2 GENERIERUNG MINI-EBV-IMMORTALISIERTER B-ZELLINEN (MINI-LCLS) 45
3.2.1 HERSTELLUNG INFEKTIOESER MINI-EBV-VIRIONEN 45
3.2.2 GENERIERUNG VON PP65MINI-LCLS 46
INHALTSVERZEICHNIS JJJ
3.2.3 MINI-LCLS SIND FREI VON WILDTYP-VIRUS 47
3.2.4 PP65 WIRD IN MINI-LCLS EXPRIMIERT 47
3.2.5 PP65MINI-LCLS EXPRIMIEREN HLA KLASSE I UND II, KOSTIMULATOREN 49
UND ADHAESIONSMOLEKUELE
3.3 REAKTIVIERUNG VON PP65-SPEZIFISCHEN T-ZELLEN 50
3.3.1 MIT PP65MINI-LCLS KOENNEN T-ZELLINIEN STIMULIERT 51
UND EXPANDIERT WERDEN
3.3.2 PP65MINI-LCL-STIMULIERTE T-ZELLINIEN SIND ZYTOTOXISCH AKTIV 52
UND LYSIEREN PP65MINI-LCLS
3.3.3 PP65-REAKTIVE T-ZELLINIEN WERDEN VON CD8+-T-ZELLEN DOMINIERT 54
3.3.4 TDA-FREISETZUNG UND CHROM-FREISETZUNG SIND VERGLEICHBAR 54
3.3.5 UNABHAENGIG GENERIERTE MINI-LCLS HABEN ALS ZIELZELLEN 55
GLEICHE EIGENSCHAFTEN
3.3.6 ALLOGENE HLA-INKOMPATIBLE MINI-LCLS WERDEN NICHT LYSIERT 57
3.3.7 PP65MINI-LCL-STIMULIERTE T-ZELLEN BLEIBEN BEI LANGZEIT- 58
KULTIVIERUNG PP65-REAKTIV
3.3.8 PP65-REAKTIVE T-ZELLINIEN SEZERNIEREN ANTIGENSPEZIFISCH
INTERFERON-Y 58
3.3.9 PP65MINI-LCLS REAKTIVIEREN PP65-REAKTIVE T-ZELLEN 60
NUR AUS CMV-POSITIVEN SPENDERN
3.3.10 PP65-REAKTIVE T-ZELLINIEN LYSIEREN CMV-INFIZIERTE, 65
PP65-VACCINIA-INFIZIERTE UND PP65-PEPTID-GEPULSTE FIBROBLASTEN
3.3.11 DIREKTE VISUALISIERUNG PP65-EPITOPSPEZIFISCHER T-ZELLEN 68
DURCH TETRAMER-FAERBUNG
3.3.12 REAKTIVIERUNG VON T-ZELLINIEN AUS (CMV+/EBV+)-SPENDERN 70
3.3.13 VERSCHIEBUNG VON SPEZIFITAETEN BEI LANGZEITKULTIVIERUNG 74
3.3.14 ERMITTLUNG DES HLA-RESTRIKTIONSSPEKTRUMS 79
MIT CMV-INFIZIERTEN FIBROBLASTEN
3.3.15 UEBERBLICK UEBER DIE PP65-TETRAMERFAERBUNGEN 81
INHALTSVERZEICHNIS IV
4 DISKUSSION 82
4.1 VEKTORKONSTRUKTION UND B-ZELL-IMMORTALISIERUNG 82
4.2 PP65: MODELLANTIGEN UND THERAPEUTISCHES ZIELANTIGEN 83
4.3 GENERIERUNG PP65-SPEZIFISCHER T-Z^LLINIEN MITTELS MINI-LCLS 85
4.3.1 MINI-LCLS ALS STIMULATOREN UND ALS ZIELZELLEN 85
4.3.2 HLA-UNRESTRINGIERTE REAKTIVITAETEN 87
4.3.3 PP65-SPEZIFISCHE T-ZELLINIEN AUS CMV-SEROPOSITIVEN SPENDERN 88
4.3.4 TETRAMER-ANALYSEN 89
4.4 STRATEGIEN DER GENERIERUNG CMV-REAKTIVERT-ZELLKULTUREN 90
4.4.1 DENDRITISCHE ZELLEN 91
4.4.2 EBV-LCLS 93
4.4.3 PRIMAERE T-ZELLAKTIVIERUNG 95
4.5 AUSBLICK 96
5 ZUSAMMENFASSUNG 97
6 LITERATUR 99
ABKUERZUNGEN
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