Myc-Funktion im Zellwachstum und Identifikation von neuen Myc-regulierten Genen in B-Zellen:
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GLIEDERUNG
I
EINLEITUNG
1.
VORWORT
1
2.
DAS
NTYC
GEN
2
2.1.
NTYC
UND
TUMORENTSTEHUNG
3
2.2.
ERKENNTNISSE
UEBER
DIE
FUNKTION
VON
MYC
4
2.2.1.
MYC
IST
EIN
TRANSKRIPTIONSFAKTOR
4
2.2.2.
MYC
REGULIERTE
GENE
4
2.3.
MYC
IN
DER
ZELLZYKLUSREGULATION
6
2.3.1.
KONTROLLE
DES
RESTRIKTIONSPUNKTES
6
2.3.2.
MYC
AKTIVIERT
CYCLINE/CDK2
8
2.4.
MYC-FUNKTION
IM
PROGRAMMIERTEM
ZELLTOD
(APOPTOSE)
10
2.5.
MYC
IN
DER
ZELLDIFFERENZIERUNG
1
1
2.6.
RWYC-FUNKTION
IM
ZELLWACHSTUM
12
2.6.1.
KOORDINATION
VON
ZELLWACHSTUM
UND
ZELLZYKLUS
12
2.6.2.
MYC
INDUZIERT
PROTEINSYNTHESE
UND
METABOLISMUS
13
3.
ZIELSETZUNG
DER
ARBEIT
14
II
MATERIAL
&
METHODEN
16
1.
MATERIAL
16
1.1.
CHEMIKALIEN
16
1.2.
RADIOAKTIVE
ISOTOPE
17
1.3.
ENZYME
17
1.4.
ANTIKOERPER
17
1.5.
VERBRAUCHSMATERIAL
UND
KITS
17
1.6.
GERAETE
18
2.
ZELLKULTUR
19
2.1.
DIE
ZELLINIE
P493-6
19
2.1.1.
TETRACYC/IRT-REGULIERBARE
WY
'
C'E
X
P
RESS
ONSVE
K
TOREN
19
2.1.2.
ENTSTEHUNG
DER
ZELLINIE
P493-6
20
2.2.
KULTIVIERUNG
VON
ZELLEN
21
2.3.
EINFRIEREN
UND
AUFTAUEN
VON
ZELLEN
21
2.4.
BESTIMMEN
DER
LEBENDZELLZAHL
23
2.5.
ARRETIERUNG
UND
MYC-INDUKTION
IN
P493-6-ZELLEN
23
GLIEDERUNG
2.6.
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ZELLZYKLUSVERTEILUNG
23
2.6.1.
BESTIMMUNG
DER
S-PHASE
DURCH
3
H-THYMIDIN-EINBAU
23
2.6.2.
PROPIDIUMJODID
(PI)-FAERBUNG
24
2.7.
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
APOPTOTISCHER
ZELLEN
24
2.7.1.
DAPL-FAERBUNG
24
2.7.2.
APOPTOTISCHE
ZELLEN
DURCH
PI-FAERBUNG
24
2.8.
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
ZELLMORPHOLOGIE
24
2.8.1.
ZELLGROESSENBESTIMMUNG
24
2.8.2.
MAY-GRUENWALD
/
GIEMSA
FAERBUNG
25
2.9.
METHODEN
ZUR
BESTIMMUNG
DER
STOFFWECHSEL-AKTIVITAET
25
2.9.1.
MTT-ASSAY
25
2.9.2.
BESTIMMUNG DER
PROTEINSYNTHESE
25
3.
RNA-ANALYSE
26
3.1.
ISOLIERUNG
VON
GESAMTZELLULAERER
RNA
26
3.1.1.
PRAEPARATION
IN
GROSSEM
MASSSTAB
(UEBER
1
MG)
26
3.1.2.
PRAEPARATION
KLEINERER
MENGEN
RNA
26
3.2.
NORTHERN-BLOT-ANALYSE
26
3.3.
NUKLEAERER
RUN-ON
27
3.3.1.
ISOLIERUNG
VON
ZELLKERNEN
27
3.3.2.
RUN-ON
REAKTION
27
4.
METHODEN
ZUR
DNA-ANALYSE
28
4.1.
GEBRAEUCHLICHE
METHODEN
28
4.2.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
VON
DNA
AUS
AGAROSEGELEN
28
4.3.
POLYMERASE-KETTEN-REAKTION
(PCR)
28
4.4.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
VON
DNA
29
4.5.
SYNTHESE
VON
CDNA
29
4.5.1.
SYNTHESE
DES
ERSTEN
STRANGS
(RT
ANSATZ)
29
4.5.2.
SYNTHESE
DES
ZWEITEN
STRANGS
29
4.6.
HYBRIDISIERUNGSPROBEN
FUER
NORTHERN-BLOT-ANALYSEN
30
4.7.
DNA-SEQUENZIERUNG
31
5.
PROTEIN-ANALYSE
31
5.1.
WESTERN-BLOT-ANALYSE
31
5.1.1.
ZELLAUFSCHLUSS
31
5.1.2.
PROTEINBESTIMMUNG
NACH
BRADFORD
(1978)
31
5.1.3.
SDS-GELELEKTROPHORESE
31
5.1.4.
WESTERN-BLOT
32
GLIEDERUNG
5.1.5.
ANTIKOERPER-BEHANDLUNG
32
5.2.
NACHWEIS
DER
CDK2-AKTIVITAET
32
5.2.1.
IMMUNPRAEZIPITATION
32
5.2.2.
BESTIMMUNG
DER
HISTON
HL-KINASE-AKTIVITAET
33
6.
ANALYSE
VON
MICROARRAYS
33
6.1.
HYBRIDISIERUNG
VON
CDNA-FILTERARRAYS
33
6.2.
ANALYSE
VON
OLIGONUKLEOTID-ARRAYS
(GENCHIPS)
34
6.2.1.
HERSTELLUNG BIOTIN-MARKIERTER
CRNA
34
6.2.2.
HYBRIDISIERUNG
UND
WASCHEN
DER
GENCHIPS
34
6.2.3.
BESCHREIBUNG
DER
GENCHIPS
35
6.2.4.
ALGORITHMEN
BEI
DER
AUSWERTUNG
DER
GENCHIPS
36
6.2.4.I.
SCANNEN
DER
CHIPS
36
6.2.4.2.
HINTERGRUND
UND
RAUSCHEN
36
6.2.4.3.
ALGORITHMEN
ZUR
BESTIMMUNG
VON
ABSCALL
36
6.2.4.4.
NORMALISIERUNG
37
6.2.4.5.
ALGORITHMEN
ZUR
BESTIMMUNG
VON
DIFFCALL
38
6.2.4.6.
BERECHNUNG
DER
FOLD
CHANGE
40
III
ERGEBNISSE
41
1.
MYC
ABHAENGIGE
PHENOTYPEN
DER
ZELLINIE
P493-6
41
1.1.
REGULIERBARKEIT
VON
MYC
DURCH
TETRACYCLIN
41
1.2.
PROLIFERATION
VON
P493-6-ZELLEN
43
1.2.1.
ZUR
PROLIFERATION
BENOETIGEN
P493-6-ZELLEN
MYC
UND
FKS
43
1.2.2.
INDUKTION
VON
S-PHASE
UND
ZELLZYKLUSREGULATION
46
13.
MYC
REGULIERT
ZELLWACHSTUM
UNABHAENGIG
VON
ZELLZYKLUSKONTROLLE
49
1.3.1.
MYC-REGULIERTE
GENE
BEI
FKS-ENTZUG
49
1.3.2.
ZELLWACHSTUM
BEI
FKS-ENTZUG
50
1.3.3.
INDUKTION
VON
PROTEIN-SYNTHESE
UND
STOFFWECHSEL
BEI
FKS-ENTZUG
55
2.
IDENTIFIKATION
NEUER
ZIELGENE
VON
MYC
58
2.1.
REGULATION
VON
MYC-ZIELGENEN
IN
P493-6-ZELLEN
58
2.2.
CDK4
WIRD
VON
MYC
UND
TGF-SS
GEGENSAETZLICH
REGULIERT
59
2.3.
IDENTIFIKATION
VON
MYC-ZIELGENEN
UBER
DIE
TRANSKRIPTIONELLE
AKTIVITAET
61
2.4.
IDENTIFIKATION
VON
MYC-ZIELGENEN
MIT
GENCHIPS
67
2.5.
BESTAETIGUNG
DER
ARRAY-ERGEBNISSE
71
GLIEDERUNG
IV
DISKUSSION
74
1.
DIE
ZELLINIE
P493-6
74
1.1
MYC
INDUZIERT
IN
P493-6-ZELLEN
KEINE
APOPTOSE
BEI
SERUM-ENTZUG
75
1.2.
P493-6
ALS
BURKITT-LYMPHOM-MODELL
76
2.
MYC
ALS
KOORDINATOR
VON
ZELLZYKLUS
UND
ZELLWACHSTUM
77
2.1.
P493-6-ZELLEN
PROLIFERIEREN
NUR
BEI
ANWESENHEIT
VON
FKS
UND
MYC
77
2.2.
MYC
INDUZIERT
ZELLWACHSTUM
78
2.3.
CDK4
ALS
MYC-ZIELGEN
80
3.
IDENTIFIZIERUNG
VON
MYC-REGULIERTEN
GENEN
MIT
ARRAY
81
TECHNIKEN
3.1.
GEMEINSAME
ERGEBNISSE
AUS
BEIDEN
METHODEN
81
3.2.
DIREKTE
ODER
INDIREKTE
ZIELGENE
VON
MYC?
83
3.3.
FUNKTION
DER
IDENTIFIZIERTEN
GENE
84
3.3.1.
MYC-REGULIERTE
GENE
IN
DER
PROTEINSYNTHESE
85
3.3.2.
MYC-REGULIERTE
GENE
IM
NUKLEOLUS
86
3.3.3.
MYC-REGULIERTE
GENE
IN
DER
DNA-SYNTHESE
86
3.3.4.
WEITERE
MYC-REGULIERTE
GENE
IN
DER
WACHSTUMSREGULATION
87
3.3.5.
MYC-REGULIERTE
GENE
IN
DER
SIGNAL-TRANSDUKTION
87
3.3.6.
MYC-REGULIERTE
GENE
IN
DER
APOPTOSE
89
3.3.7.
MYC-REPRIMIERTE
GENE
89
4.
BEDEUTUNG
DER
ERGEBNISSE
FUER
DIE
BIOLOGIE
VON
MYC
90
5.
AUSBLICK
95
V
ZUSAMMENFASSUNG
96
VI
LITERATURVERZEICHNIS
98
VII
ANHANG
115
1.
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
115
2.
LEBENSLAUF
117
3.
PUBLIKATIONSLISTE
118
4.
DANKSAGUNG
119 |
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