Mitochondriale Transportproteine in Saccharomyces cerevisiae:
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| Published: |
2002
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INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1 ALLGEMEINE EINLEITUNG.1
1.1 SACCHAROMYCES CEREVISIAE: EIN EINZELLIGER EUKARYOT.1
1.1.1 WIRTSCHAFTLICHE BEDUTUNG VON
SACCHAROMYCES CEREVISIAE.1
1.1.2 S. CEREVISIAE ALS MODELLORGANISMUS.
1
1.1.3 KOHLENHYDRATSTOFFWECHSEL IN BAECKERHEFE.
1
1.2 MITOCHONDRIEN.
5
1.2.1 BESONDERHEITEN VON MITOCHONDRIEN AUS S. CEREVISIAE.6
1.2.2 DIE MITOCHONDRIALE DNA VON S. CEREVISIAE.6
1.2.3 MITOCHONDRIALE TRANSPORTPROTEINE.
7
1.3 ZIEL DIESER ARBEIT.8
2 MATERIAL UND METHODEN. .9
2.1 LOESUNGEN UND MATERIALIEN.G
2.2 METHODEN.
16
2.2.1 KULTUR VON S. CEREVISIAE.16
2.2.2 KONTINUIERLICHE KULTUR VON S. CEREVISIAE.16
2.2.3 ISOLIERUNG VON MITOCHONDRIEN AUS S.
CEREVISIAE.18
2.2.4 PROTEINBESTIMMUNG.18
2.2.5 MESSUNG DER AKTIVITAET VON LEITENZYMEN ZELLULAERER KOMPARTIMENTE.19
2.2.6 MESSUNG DES SAUERSTOFFVERBRAUCHS VON MITOCHONDRIEN.19
2.2.7 AUFNAHMEMESSUNGEN MIT ISOLIERTEN MITOCHONDRIEN.20
2.2.7.1 PYRUVATTRANSPORT.20
2.2.7.2 ARGININ- UND OMITHINTRANSPORT.21
2.27.3 TRYPTOPHANTRANSPORT.22
2.2.7 4 RECHNERGESTUETZTE AUSWERTUNG DER TRANSPORTMESSUNGEN.22
2.2.8 SELEKTIVE PERMEABILISERUNG VON S. CEREVISIAE MIT NYSTATIN.22
2.2.9 ENZYMATISCHE BESTIMMUNGEN.23
2.2.9.1 GLUCOSE.23
2.2.9.2 ETHANOL.23
2.2.9.3 LACTAT.24
2.2.10 HERSTELLUNG UND TRANSFORMATION KOMPETENTER HEFEZELLEN.24
2.2.11 DELETION VON ORT1 IN S. CEREVISIAE.25
2.2.12 ENTFERNEN DES KANMX-MODULS AUS DEM GENOM VON TRANSFORMIERTEN HE
FEZELLEN .25
2.2.13 NACHWEIS DER DELETION VON ORT1 DURCH COLONY PCR.25
2.2.14 HPLC-ANALYSE VON AMINOSAEUREN.26
2.2.15 NATRIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE).
27
2.2.16 WESTERN BLOT.27
2.2.17 HERSTELLUNG VON MITOCHONDRIALEN EXTRAKTEN ZUR BESTIMMUNG VON
MAGNE
SIUM .29
2.2.18 BESTIMMUNG DES GEHALTS AN MG, CA UND FE IN EXTRAKTEN AUS
HEFEMITO-
CHONDRIEN MITTELS ICP-MS.29
2.2.19 BESTIMMUNG DES GEHALTS AN MG IN EXTRAKTEN AUS HEFEMITOCHONDRIEN
MITTELS AAS.29
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/965315436
INHALTSVERZEICHNIS
3
DIE MCH-PROTEINFAMILIE UND MITOCHONDRIALER MONOCARBOXY-
LATTRANSPORT.
3.1 EINLEITUNG.
3.2 ERGEBNISSE.
3.2.1 PRAEPARATION VON MITOCHONDRIEN AUS SACCHAROMYCES CEREVISIAE.
3.2.2 NACHWEIS DER MITOCHONDRIALEN LOKALISATION VON MCH3P.
3.2.3 KINETIK DER PYRUVATVERATMUNG VON MITOCHONDRIEN AUS
S. CEREVISIAE K26 WT, MCH3 UND MCH1-5.
3.2.4 WACHSTUM VON S.
CEREVISIAE K26 WT UND MCH1-5 IM SCHUETTELKOLBEN
MIT VERSCHIEDENEN KOHLENSTOFFQUELLEN.
3.2.5 GLUCOSELIMITIERTE KONTINUIERLICHE KULTUR VON S. CEREVISIAE K26 WT,
MCH3 UND MCH 1-5.
3.2.6 MITOCHONDRIALE ATMUNG MIT VERSCHIEDENEN HEMMSTOFFEN.
3.2.7 PYRUVATTRANSPORT VON MITOCHONDRIEN AUS S. CEREVISIAE K26 WT
UND
MCH1-5.
3.2.8 LACTATBESTIMMUNG AUS S. CEREVISIAE K26 WT UND MCH1-5.
3.3 DISKUSSION.
30
30
30
31
32
35
36
37
41
44
45
4 ANDERE FUNKTIONEN DER MCH-PROTEINFAMILIE
48
4.1 EINLEITUNG.
4.2 ERGEBNISSE.Z.".".
4.2.1 WACHSTUM VON HEFEZELLEN MIT TRYPTOPHAN ALS N-QUELIE
4.2.2 TRANSPORT VON TRYPTOPHAN.
4.2.3 AMINOSAEUREN IN WT-, MCH3- UND MCH1-5-ZEUER\
.Z
4.3 DISKUSSION.
48
49
49
50
52
53
5 TRANSPORTFUNKTIONEN VON MITGLIEDERN DER MITOCHONDRIALEN CARRIER
FAMILIE. M
5.1 EINLEITUNG.
56
5.2 ERGEBNISSE.* .
57
5.2.1 ATMUNGSAKTIVITAET VON MITOCHONDRIEN AUS S. CEREVISIAE MIT
DELETIONEN VON YDL198C, YER053C, YOR222W UND YPL134C.
57
5.2.2 WACHSTUM VON S. CEREVISIAE MIT DELETIONEN VON YDL198C, YER053C
YOR222W UND YPL134C. '
58
5.2.3 DIE EINZELDELETIONSMUTANTE K
1
AYDL198C (YHM
1
).61
5.2.4 WELCHE AMINOSAEUREN FOERDERN DAS WACHSTUM VON
S. CEREVISIAE YHM1 AUF MINIMALMEDIUM MIT GLUCOSE?.62
5.2.5 WACHSTUM VON S. CEREVISIAE K
1
WT UND YHM1 IN VERSCHIEDENEN MEDIEN65
5.2.6 VERATMUNG VON PROLIN UND GLUTAMAT DURCH MITOCHONDRIEN
AUS S.
CEREVISIAE K1 WT UND YHM1. 67
5.2.7 DELETION VON ORT
1
IN WT- UND YHM1-HEFEZELLEN.
68
5.2.8 WACHSTUM VON S. CEREVISIAE K1 WT, YHM1, ORT1 UND YHM1/ORT1 IN VER
SCHIEDENEN MEDIEN.
69
5.2.9 WACHSTUM VON BY-ZELLEN. 71
C'O AMINOSAEUREGEHALT VON S.
CEREVISIAE K
1
WT, YHM1, ORT1 UND YHRNL/ORTL 74
OE.Z.
11
AUFNAHMEMESSUNGEN AN ISOLIERTEN MITOCHONDRIEN.
77
5.2.11.1 GLUTAMATAUFNAHME. 77
5.2.1
1.2
AUFNAHME VON ARGININ UND ORNITHIN.
77
INHALTSVERZEICHNIS
5.2.12 BESTIMMUNG DES MAGNESIUMGEHALTS VON MITOCHONDRIEN AUS
S. CEREVISIAE K1 WT UND YHM1.
79
5.3 DISKUSSION.81
5.3.1 IST DER MITOCHONDRIALE PYRUVATCARRIER EIN MCF-MITGLIED?.81
5.3.2 WAS IST DIE FUNKTION VON YHMLP?.82
5.3.3 WARUM KONNTE ARGININZUGABE BEI WACHSTUM MIT ETHANOL ODER
PROLIN DAS FEHLEN VON YHMLP NICHT AUSGLEICHEN?.83
5.3.4 WARUM KONNTE ARGININZUGABE BEI WACHSTUM MIT GLUCOSE
UND AMMONIUM DAS FEHLEN VON YHMLP AUSGLEICHEN?.85
5.3.5 WARUM HATTEN DIE BY YHM1- UND ORT1-ZELLEN EINEN ANDEREN
PHAENOTYP ALS DIE ENTSPRECHENDEN K1 YHM1- UND ORT1-ZELLEN?.89
5.3.6 IST YHMLP EIN MAGNESIUMTRANSPORTER?.90
5.3.7 WAS IST DIE FUNKTION VON YHMLP?.
91
6 ZUSAMMENFASSUNG. 92
7 LITERATUR.94
III |
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