Die Rolle von CcpA bei der Verknüpfung von Kohlenstoff- und Stickstoff-Stoffwechel in Bacillus subtilis:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
.
I
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS
.
V
1.
ZUSAMMENFASSUNG
.
1
2.
EINLEITUNG
_
.
_
.
_
.
_
.
_
.
2
2.1.
GRUNDSTOFFWECHSELWEGEIN
BACILLUS
SUBTILIS
_
.
_
.
_
.
2
2.1.1.
ZUCKERAUFHAHME
IN
B.
SUBTILIS
.
2
2.1.2.
GLYKOLYSE
IN
B.
SUBTILIS
.
4
2.1.3.
PENTOSEPHOSPHATWEG
UND
ZITRONENSAEUREZYKLUS
IN
B.
SUBTILIS
.
6
2.1.4.
UEBERFLUSS-STOFFWECHSEL
.
7
2.2.
DER
TRANSKRIPTIONSREGULATOR
CCPA
.
-----
.
_
.
--------
.
9
2.2.1.
KOHLENSTOFF-KATABOLITEN-REPRESSION
(CCR)
.
9
2.2.2.
FUNKTION
VON
CCPA
BEI DER
KOHLENSTOFF-KATABOLITEN-REPRESSION
.
9
2.2.3.
DIE
HPR-KINASE:
DER
SIGNALGEBER
FUER
CCPA
.
10
2.2.4.
CCPA
ALS
AKTIVATOR
DER
GENEXPRESSION
.
11
23.
EINFLUSS
VON
CCPA
AUF
DAS
WACHSTUM
VON
B.
SUBTILIS
.
11
2.3.1.
PHAENOTYPEN
EINER
CCPA-MUTANTE
.
11
2.3.2.
MOEGLICHKEITEN
DER
SUPPRESSION
DER
CCPA-MUTATION
.
13
2.4.
ZIELE
DER
ARBEIT
.
_
.
_
.
_
.
.
14
3.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
_
.
.
.
_
.
15
3.1.
BAKTERIENSTAEMME
UND
PLASMIDE
_
.
_
.
_
.
_
.
15
3.1.1.
BAKTERIENSTAEMME
.
15
3.1.2.
PLASMIDE
.
17
3.2.
PUFFER,
LOESUNGEN
UND
MEDIEN
.
_
.
_
.
_
.
_
.
18
3.2.1.
BAKTERIENNAEHRMEDIEN
UND
FAKULTATIVE
ZUSAETZE
.
19
33.
METHODEN
.
_
.
_
.
_
.
.
22
3.3.1.
ALLGEMEINE
METHODEN
.
22
3.3.2.
ANZUCHT VON
BAKTERIEN
.
23
3.3.3.
TRANSFORMATION
VON
E.
COLI
.
23
3.3.4.
TRANSFORMATION
VON
B.
SUBTILIS
.
23
INHALTSVERZEICHNIS
N
HERSTELLUNG
VON
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
23
TRANSFORMATION
DER
KOMPETENTEN
ZELLEN
.
24
3.3.5.
STAMMKONSTRUKTION
IN
B.
SUBTILIS
.
24
KONSTRUKTION
EINER
CCPA-DELETIONSMUTANTE
.24
KONSTRUKTION
EINER
CGGR-DELETIONSMUTANTE
.
25
KONSTRUKTION
EINES
STAMMES
MIT
EINEM
XYLOSE-INDUZIERBAREN
UV
LEU-OPERON
.
26
3.3.6.
PRAEPARATION
UND
NACHWEIS
VON
DNA
.
27
AUFREINIGUNG
VON
PLASMID-DNA
UEBER
MODIFIZIERTE
ALKALI/SDS-LYSE
.
27
ISOLIERUNG
VON
CHROMOSOMALER
DNA
AUS
B.
SUBTILIS
.
27
DNA-GEL-ELEKTROPHORESE
.
27
SEQUENZIERUNG
VON
DNA
.
28
RESTRIKTION
UND
LIGATION
VON
DNA
.
28
POLYMERASEKETTENREAKTION
(PCR)
.
28
3.3.7.
ARBEITEN
MIT
PROTEINEN
.
30
ZELLAUFSCHLUSS
DURCH
ULTRASCHALL
.30
ZELLAUFSCHLUSS
MIT
DER
FIENCH
PRESS
.
30
DENATURIERENDE
PROTEINGEL-ELEKTROPHORESE
.
30
NATIVE
PROTEINGEL-ELEKTROPHORESE
.
31
WESTEMBLOT
.
31
3.3.8.
BESTIMMUNG
VON
ENZYMAKTIVITAETEN
.
34
BESTIMMUNG
DER
SS-GALAKTOSIDASEAKTIVITAET
.34
AMYLASETEST
AUF
STAEIKEPLATTEN
.
35
3.3.9.
ZUCKERAUFHAHMEMESSUNGEN
BEI
B.
SUBTILIS
.
36
3.3.10.
RNA-ANALYTIK
.
37
RNA-ISOLATION
AUS
B.
SUBTILIS
.
37
ELEKTROPHORESE
VON
RNA
IN
DENATURIERENDEN
AGAROSEGELEN
.
39
NORTHEMBLOT
.
40
HERSTELLUNG
DIG-MARKIERTER
RNA-SONDEN
.
41
HYBRIDISIERUNG
MEMBRANGEBUNDENER
RNA
MIT
DIG-MARKIERTEN
RNA-SONDEN
.
42
DETEKTION
VON
RNA/RNA-HYBRIDEN
.
42
PRIMEREXTENSION
.
43
4.
ERGEBNISSE
-----
.
------
.
------.----
.
-----.
-
.
-----
.
----
.
-
48
4.1.
TRANSKRIPTIONSKONTROLLE
GLYKOLYTISCHER
GENE
IN
B.
SUBTILIS
.
_
.
-
.
48
4.1.1.
ANORDNUNG
GLYKOLYTISCHER
GENE
AUF
DEM
CHROMOSOM
VON
B.
SUBTILIS
.
48
4.1.2.
TRANSKRIPTIONELLE
ORGANISATION
GLYKOLYTISCHER
GENE
I:
ENZYME
ZUR
UMWNDLUNG
DER
HEXOSEPHOSPHATE
.
49
4.1.3.
TRANSKRIPTIONELLE
ORGANISATION
GLYKOLYTISCHER
GENE
II:
ENZYME
ZUR
UMWNDLUNG
DER
TRIOSEPHOSPHATE
.
52
INHALTSVERZEICHNIS
M
4.1.4.
CHARAKTERISIERUNG
EINER
MRNA-PROZESSIERUNGSSTELLE
IM
3
'
-BEREICH
VON
CGGR
.
57
4.1.5.
REGULATION
DES
GAPA
-OPERONS
DURCH
DEN
REPRESSOR
CGGR
.
59
4.2.
DER
EINFLUSS
VON
CCPA
AUF
DIE
PTS-AKTIVITAET
IN
B.
SUBTILIS
.
.
63
4.2.1.
DIE
INDIREKTE
ROLLE
VON
CCPA
BEI
DER
INDUKTION
DES
GAPA-OPERONS
.
63
4.2.2.
DIE
ROLLE
VON
CCPA
BEI
DER
INDUKTION
DES
GAPA-OPERONS
DURCH
PTS-ZUCKER
.
64
4.2.3.
KONTROLLE
DES
ZUCKERTRANSPORTS
DURCH
CCPA
.
66
4.2.4.
DER
EINFLUSS
VON
CCPA
AUF
DIE
EXPRESSION
DES
PTSGHI-OPERONS
.
67
4.2.5.
KONTROLLE
DES
PHOSPHORYLIERUNGSZUSTANDES
VON
HPR
DURCH
CCPA
.
68
4.2.6.
DIE
MOEGLICHKEIT
DER
SUPPRESSION
EINER
CCPA-MUTANTE
.
70
4.2.7.
INDUKTION
DES
GAPA-OPERONS
IN
EINER
CCPA
PTSHL
-DOPPELMUTANTE
.
71
43.
WACHSTUMSDEFEKT
EINER
CCPA-MUTANTE
IN
MINIMAHNEDIEN
.
73
4.3.1.
GLUTAMAT-UND
SUCCINATBEDUERFTIGKEIT
EINER
CCPA-MUTANTE
.
73
4.3.2.
SUPPRESSION
DES
WACHSTUMSDEFEKTS
EINER
CCPA-MUTANTE
.
75
4.3.3.
FUNKTIONEN
DER
DNA-BINDENDEN
DOMAENE
VON
CCPA
.
77
4.4.
EINFLUSS VON
CCPA
AUF
DEN
AMINOSAEURESTOFFWECHSEL
.
----------
.
------
.
80
4.4.1.
EIN
MINIMALMEDIUM,
DAS
DEN
WACHSTUMSDEFEKT
EINER
CCPA-MUTANTE
VOLLSTAENDIG
AUFHEBT
.
80
4.4.2.
DETAILANALYSE
DER
AMINOSAEUREBEDUERFTIGKEIT
EINER
CCPA-MUTANTE
.
82
4.4.3.
EINFLUSS
VON
CCPA
AUF
DIE
EXPRESSION
DES
ILV
ZEU-OPERONS
.
84
4.4.4.
REGULATION
VON
PROMOTOREN
DER
BIOSYNTHESEGENE
VERZWEIGTKETTIGER
AMINOSAEUREN
.
85
4.4.5.
XYLOSE-INDUZIERBARE
EXPRESSION
DES ILV
ZEN-OPERONS
IN
DER
CCPA-MUTANTE
.
88
5.
DISKUSSION
.
92
5.1.
GENREGULATION
ALS
SPIEGELBILD
DES
NAEHRSTOFFANGEBOTS
_
.
_
.
92
5.1.1.
ZUCKER-ABHAENGIGE
REGULATION
GLYKOLYTISCHER
GENE
UND
OPERONS
IN
B.
SUBTILIS
.
92
5.1.2.
DER
EINFLUSS
VON
ZUCKERN
UND
AMINOSAEUREN
AUF
DIE
EXPRESSION
VON
GENEN
DES
ZENTRALEN
STOFFWECHSELS
.
94
5.2.
TRANSKRIPTIONELLE
ORGANISATION
DES
GAPA
-OPERONS
VON
B.
SUBTILIS
---------
.
97
53.
NEUE
FUNKTIONEN
VON
CCPA
IN
B.
SUBTILIS
.
_
.
------
.102
53.1.
DER
EINFLUSS
VON
CCPA
AUF
DIE
AKTIVITAET
DER
HPR-KINASE
.
102
5.3.2.
DIE
ROLLE
VON
CCPA
BEI
DER
REGULATION
VON
GENEN
DES
ZENTRALEN
STOFFWECHSELS:
EINE
NEUE
KLASSE
VON
GENEN
DES
CCPA-MODULONS
.
105
5.4.
DER
WACHSTMNSDEFEKT
EINER
CCPA-MUTANTE
.
.-------.108
5.4.1.
DIE
GLUTAMATBEDUERFTIGKEIT
EINER
CCPA-MUTANTE
.
108
INHALTSVERZEICHNIS
IV
5.4.2.
DIE
ROLLE
VON
CCPA
BEI
DER
BIOSYNTHESE
VON
VERZWEIGTKETTIGEN
AMINOSAEUREN
UND
VON
METHIONIN
.
110
5.5.
AUSBLICK
.
---
.
-
.
-
.
112
6.
LITERATURVERZEICHNIS
.
-
.
-
.
-
.
-
.
_
.
_
.
_
114
7.
ANHANG
.
_
.
_
.
-
._
.
_
.133
7.1.
MATERIALIEN
-
.
.
_
.
-
.
_
.
_
.
_
.133
7.1.1.
CHEMIKALIEN
.
133
7.1.2.
RADIOCHEMIKALIEN
.
134
7.1.3.
HILFSMITTEL
.
.
.
134
7.1.4.
GERAETE
UND
APPARATUREN
.
135
7.1.5.
KOMMERZIELL
ERHAELTLICHE
SYSTEME
.
136
7.1.6.
PROTEINE,
ANTIKOERPER
UND
ENZYME
.
136
7.2.
OLIGONUKLEOTIDE
.
------.----
.
-
.
_
.
_
.
-
.137
73.
VERWENDETE
INTERNETANGEBOTE
.
-
.
-
.
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.
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