Lokalisation des Extraneuronalen Monoamin-Transporters (EMT):
Gespeichert in:
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| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2002
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INHALTSVERZEICHNIS
ABKUERZUNGEN
IV
EINBUCHSTABENCODE DER AMINOSAEUREN
VI
1 EINLEITUNG
1
1.1 FUNKTION DER MONOAMIN-TRANSPORTER 1
1.2 NEURONALE MONOAMIN-TRANSPORTER 3
1.3 NICHT-NEURONALE MONOAMIN-TRANSPORTER 3
1.3.1 DER EXTRANEURONALE MONOAMIN-IRANSPORTER (EMT) 4
1.3.2 BEDEUTUNG DES EXTRANEURONALEN MONOAMIN-TRANSPORTERS (EMT) 6
1.4 UST1 UND UST4 - ZWEI WEITERE MITGLIEDER DER ASF-FAMILIE 7
1.5 ZIEL DER VORLIEGENDEN ARBEIT 8
2 MATERIAL UND METHODEN 9
2.1 ALLGEMEINES
9
2.2 MATERIAL
9
2.2.1 CHEMIKALIEN UND ENZYME 9
2.2.2 PUFFER UND STAMMLOESUNGEN 9
2.2.3 NAEHRMEDIEN 15
2.2.4 KITS 15
2.2.5 OLIGONUKLEOTIDE 16
2.2.6 RADIOCHEMIKALIEN 16
2.2.7
E. COLI BAKTERIENSTAMM 17
2.2.8 PLASMIDE 17
2.2.9 EUKARYOTEN-ZELLLINIE 17
2.3 MIKROBIOLOGISCHE METHODEN 18
2.3.1 KULTUR UND LAGERUNG VON
E. COLI 18
2.3.2 ELEKTROTRANSFORMATION VON .
COLI 19
2.4 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 20
2.4.1 PHENOL-CHLOROFORM-EXTRAKTION 20
2.4.2 ALKOHOLPRAEZIPITATION VON DNA UND RNA 20
2.4.3 RESTRIKTION VON DNA 21
2.4.4 PHOSPHORYLIERUNG, GLAETTUNG UND DEPHOSPHORYLIERUNG VON DNA-ENDEN 21
2.4.5 LIGATION VON DNA 22
I
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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2.4.6 PRAEPARATION VON PLASMID-DNA AUS
E. COLI 23
2.4.7 PRAEPARATION VON RNA 23
2.4.8 AGAROSEGELELEKTROPHORESE NATIVER DNA 24
2.4.9 ISOLIERUNG VON DNA DURCH UV-GESCHUETZTE PRAEPARATIVE
AGAROSEGELELEKTROPHORESE 25
2.4.10 POLY(A)
+-SELEKTION VON MRNA AN OLIGO(DT)-CELLULOSE 26
2.4.11 AGAROSEGELELEKTROPHORESE DENATURIERTER RNA 27
2.4.12 NORTHERN-BLOT-ANALYSE 28
2.4.13 RADIOAKTIVE MARKIERUNG VON DNA 29
2.4.14 RNA-(RT)-PCR 29
2.4.15 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) ZUR AMPLIFIKATION VON DNA 30
2.4.16 KOLONIE-PCR 31
2.4.17 SEQUENZIERUNG VON DNA 32
2.4.18 HERSTELLUNG VON SONDEN FUER DIE
IN SITU HYBRIDISIERUNG 33
2.4.19
IN SITU HYBRIDISIERUNG 35
2.4.20 SPOT-TEST-ANALYSE 36
2.5 BIOCHEMISCHE METHODEN 36
2.5.1 DEGLYKOSYLIERUNG VON MEMBRANPROTEINEN 36
2.5.2 ISOLIERUNG DER MEMBRANFRAKTION AUS HEK 293-ZELLEN 37
2.5.3 WESTEM-BLOT-ANALYSE 37
2.5.4 ANTIKOERPER 38
2.5.5 AFFINITAETSREINIGUNG DER ANTISEREN 39
2.5.6 IMMUNHISTOLOGIE 39
2.6 ZELLKULTUR ' 40
2.6.1 KULTIVIERUNG VON HEK 293-ZELLEN 40
3 ERGEBNISSE 41
3.1 UNTERSUCHUNG DER GEWEBEVERTEILUNG DURCH NORTHERN-BLOT-ANALYSE 41
PRAEPARATION VON MRNA AUS VERSCHIEDENEN RATTENORGANEN ' 41
HERSTELLUNG DER SONDEN FUER DIE NORTHERN-BLOT-ANALYSE 42
NORTHERN-BLOT-ANALYSE 44
3.2 ZELLULAERE LOKALISATION DURCH
IN SITU HYBRIDISIERUNG 47
SONDENSYNTHESE 47
IN SITU
HYBRIDISIERUNG MIT GEHIRN-SCHNITTEN 51
3.3 KONTROLLEN FUER DIE
IN SITU HYBRIDISIERUNG 51
SONDENSYNTHESE 52
PRAEPARATION DER ORGANE 55
II
LAGERUNG DER GEWEBESCHNITTE IN ETHANOL 56
EINFLUSS DER SONDENMENGE AUF DAS SIGNAL-HINTERGRUND-VERHAELTNIS 57
HYBRIDISIERUNG UND WASCHEN 59
VISUALISIERUNG DER SONDE 61
3.4 EMTR WIRD IN DER AREA POSTREMA EXPRIMIERT 62
3.5
IN SITU HYBRIDISIERUNG MIT EMBRYOSCHNITTEN 64
3.6 EMT IST IN DER AREA POSTREMA MIT MAO-B KOLOKALISIERT 71
3.7 LOKALISATION VON EMTR IN DER PLAZENTA 73
3.8 LOKALISATION VON EMT IN ANDEREN ORGANEN DURCH
IN SITU HYBRIDISIERUNG 75
3.9 LOKALISATION VON UST1 R UND UST4R 75
SONDEN FUER UST 1 R UND UST4R FUER DIE IN SITU HYBRIDISIERUNG 77
LOKALISATION VON UST 1 R IN DER NIERE 78
LOKALISATION VON UST4R IN DER LEBER - 80
3.10 GENERIERUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN EMTR 81
IMMUNCYTOLOGIE 82
IMMUNHISTOLOGIE 85
WESTEM-BLOT-ANALYSE 86
4 DISKUSSION 87
4.1 METHODIK DER
IN SITU HYBRIDISIERUNG 87
EIN TEIL DER MEHRFACH-KLONIERUNGSSTELLE DES VEKTORS PBLUESCRIPT FUEHRT ZU
ARTEFAKTEN IN DER
IN SITU HYBRIDISIERUNG 90
4.2 LOKALISATION DER MRNA DES EXTRANEURONALEN MONOAMIN-TRANSPORTERS 91
NORTHEM-BLOT-ANALYSE 91
ZELLULAERE LOKALISATION VON EMTR IN DER PLAZENTA 93
ZELLULAERE LOKALISATION VON EMTR IM GEHIRN 93
4.3 GENERIERUNG VON POLYKLONALEN ANTIKOERPERN GEGEN EMTR 95
AUSWAHL DER PEPTIDE 95
CHARAKTERISIERUNG DER ANTIKOERPER YY' 97
4.4 LOKALISATION VON UST4R IN DER LEBER 99
4.5 LOKALISATION VON UST 1 R IN DER NIERE 99
4.6 AUSBLICK 100
5 ZUSAMMENFASSUNG 102
6 LITERATURVERZEICHNIS 103
III |
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