Nachweis der Expression des Perforin-Gens in peripheren Blutlymphozyten von Patienten mit Nierentransplantaten:
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2002
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III
INHALTSVERZEICHNIS
VERZEICHNIS DER VERWENDETEN ABKUERZUNGEN VI
1. EINLEITUNG 1
1.1. IMMUNBIOLOGIE DER TRANSPLANTATABSTOSSUNG 2
1.2. LYMPHOZYTEN-VERMITTELTE ZYTOTOXIZITAET 3
1.3. INDUKTION DES ZELLTODES DURCH FREISETZUNG LYTISCHER GRANULA 4
1.4. NONSEKRETORISCHER LYSEMECHANISMUS DURCH MEMBRANGEBUNDENE EFFEKTOR
MOLEKUELE 8
1.5. PERFORIN ALS POTENTIELLER ABSTOSSUNGSMARKER 10
1.6. DIE KOMPETITIVE RT-PCR ALS METHODE DER WAHL ZUM QUANTITATIVEN NACH
WEIS DER EXPRESSION DES PERFORIN-GENS 12
2. ZIELSTELLUNG 17
3. MATERIAL UND METHODEN 18
3.1. LYMPHOZYTENSEPARATION 18
3.2. LYMPHOZYTENSTIMULATION 18
3.3. ALLGEMEINE NUKLEINSAEURETECHNIKEN 19
3.3.1. PHENOL/CHLOROPHORM/ISOAMYLALKOHOL-EXTRAKTION 19
3.3.2. FAELLUNG VON DNA 19
3.3.3. QUANTIFIZIERUNG VON NUKLEINSAEUREN MITTELS PHOTOMETRIE 20
3.3.4. ELEKTROPHORETISCHE AUFTRENNUNG VON NUKLEINSAEUREN 20
3.3.4.1. AGAROSEGEL-ELEKTROPHORESE 20
3.3.4.2. DENATURIERENDE HAMSTOFF-POLYACRYLAMID-ELEKTROPHORESE 21
3.3.5. EXTRAKTION VON DNA AUS AGAROSEGELEN 22
3.4. PRAEPARATION VON RNA 23
3.4.1. RNA-ISOLIERUNG 23
3.4.2. QUALITAET UND QUANTITAET DER RNA 24
3.5. REVERSE TRANSKRIPTASE-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR) 24
3.5.1. REVERSE TRANSKRIPTASE (RT)-REAKTION 24
3.5.2. PRIMERDESIGN 25
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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IV
3.5.3. WAHL DER PCR-BEDINGUNGEN 26
3.5.4. OPTIMIERUNG DER AMPLIFIKATIONSBEDINGUNGEN 27
3.5.5. UNTERSUCHUNG DER SPEZIFITAET VON PCR-PRODUKTEN 28
3.6. KOMPETITIVE RT-PCR-ASSAYS ZUR QUANTIFIZIERUNG DER GENEXPRESSION VON
HPRT UND PERFORIN 29
3.6.1. KONSTRUKTION DER STANDARDFRAGMENTE FUER HPRT UND PERFORIN 29
3.6.2. KLONIERUNG DER STANDARDFRAGMENTE FUER HPRT UND PERFORIN 31
3.6.3. KALIBRIERUNG DER STANDARDFRAGMENTE FUER HPRT UND PERFORIN MITTELS
HPLC 36
3.6.4. HERSTELLUNG VON VERDUENNUNGSREIHEN DER STANDARDFRAGMENTE FUER HPRT
UND
PERFORIN 37
3.6.5. DURCHFUEHRUNG KOMPETITIVER AMPLIFIKATIONSREAKTIONEN 38
3.6.6. AUSWERTUNG DER DURCH KOMPETITIVE RT-PCR ERHALTENEN ERGEBNISSE 39
3.7. PATIENTENKOLLEKTIVE 40
4. ERGEBNISSE 41
4.1. LYMPHOZYTENSEPARATION 41
4.2. RNA-ISOLIERUNG UND AUSBEUTE 41
4.3. KOMPETITIVE RT-PCR-ASSAYS ZUR QUANTIFIZIERUNG DER HPRT- UND
PERFORIN-GENEXPRESSION 42
4.3.1. ENTWICKLUNG OPTIMIERTER PCR-PROTOKOLLE ZUR AMPLIFIKATION VON
HPRT-
UND PERFORIN-CDNA 43
4.3.2. HERSTELLUNG INTERNER PCR-STANDARDS 45
4.3.3. KALIBRIERUNG UND KONFEKTIONIERUNG DER KOMPETITOREN 50
4.3.4. SENSITIVITAET DER RT-PCR-ASSAYS 50
4.3.5. PROBLEMATIK DER HETERODIMER-BILDUNG BEI DER KOMPETITIVEN RT-PCR
VON
HPRT 51
4.3.6. KINETISCHE UNTERSUCHUNG DER SIMULTANEN AMPLIFIKATION VON
HPRT-CDNA
UND HPRT- STANDARD BZW. VON PERFORIN-CDNA UND PERFORIN-STANDARD 53
4.4. UNTERSUCHUNG DER PERFORIN-GENEXPRESSION IN PERIPHEREN
BLUTLYMPHOZYTEN
VON PATIENTEN NACH NIERENTRANSPLANTATION MITTELS KOMPETITIVER RT-PCR 55
4.4.1. BASALE GENEXPRESSION VON PERFORIN IN PERIPHEREN BLUTLYMPHOZYTEN
55
4.4.2. EXPRESSION DES PERFORIN-GENS IN PERIPHEREN BLUTLYMPHOZYTEN VON
PATIEN
TEN NACH NIERENTRANSPLANTATION 55
V
5. DISKUSSION 60
5.1. ENTWICKLUNG EINER SENSITIVEN, QUANTITATIVEN NACHWEISTECHNIK ZUR
UNTER
SUCHUNG DER GENEXPRESSION VON PERFORIN IN PERIPHEREN BLUTLYMPHOZYTEN 60
5.1.1. RNA-ISOLIERUNG UND AUSBEUTE 61
5.1.2. KOMPETITIVE RT-PCR-ASSAYS UNTER ANWENDUNG INTERNER
DSDNA-STANDARDS
ZUR QUANTIFIZIERUNG DER GENTRANSKRIPTE VON HPRT UND PERFORIN 61
5.2. EXPRESSION DES PERFORIN-GENS IN PERIPHEREN BLUTLYMPHOZYTEN VON
GESUNDEN
PROBANDEN UND PATIENTEN NACH NIERENTRANSPLANTATION 67
5.3. EINSATZ DER KOMPETITIVEN RT-PCR ZUR BESTIMMUNG DER EXPRESSION DES
PERFORIN-GENS ALS SCREENING-METHODE IM RAHMEN DER ABSTOSSUNGSDIAGNO
STIK NACH NIERENTRANSPLANTATION 71
6. ZUSAMMENFASSUNG 73
7. LITERATURVERZEICHNIS 75
ANHANG |
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