Phylogenetische Analysen und antigenetische Verwandtschaft von Pestiviren:
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Wettenberg
VVB Laufersweiler
2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG 1
2. LITERATURÜBERSICHT 3
2.1. Historische Aspekte 3
2.2. Struktur und Eigenschaften von Pestiviren 5
2.3. Genomorganisation und Replikation 6
2.4. Pathogenese und Klinik 10
2.4.1. Infektionen nicht tragender Tiere 10
2.4.2. Infektionen tragender Tiere 12
2.5. Epidemiologie 13
2.6. Heterogenität von Pestiviren 14
3. MATERIAL UND METHODEN 16
3.1. Material 16
3.1.1. Zellen und Virusstämme 16
3.1.1.1. Zellen 16
3.1.1.2. Virusstämme 16
3.1.2. Plasmide und Bakterien 17
3.1.3. Antiseren und monoklonale Antikörper 17
3.1.3.1. Antiseren 17
3.1.3.2. Monoklonale Antikörper 17
3.1.4. Synthetische Oligonukleotide 18
3.1.4.1. Oligonukleotide für RT PCR 18
3.1.4.2. Oligonukleotide für die Sequenzierung 18
3.1.5. Nährmedien 18
3.1.5.1. Zellkulturmedien 18
3.1.5.2. Bakterienkulturmedien 20
3.1.6. Lösungen und Puffer 20
3.1.6.1. Lösungen 20
3.1.6.2. Puffer 21
3.1.7. Chemikalien 22
3.1.8. Enzyme 23
3.1.9. Vorgefertigte Systeme ( Kits ) 23
3.1.10. Verbrauchsmaterial 24
3.1.11. Geräte 24
3.2. Methoden 26
3.2.1. Anzucht von Gewebekulturzellen 26
3.2.2. Bestimmung der Zellzahl 26
3.2.3. Virusvermehrung 26
3.2.4. Herstellung von Virusstammlösungen 27
3.2.5. Virusnachweis 27
3.2.5.1. Indirekter Immunfluoreszenztest 27
3.2.5.2. Nachweis von zytopathogenen Pestiviren 27
3.2.6. Virustiterbestimmung und Berechnung der GKID50 27
I
Inhaltsverzeichnis
3.2.7. RNA Präparation 28
3.2.8. Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion 28
3.2.8.1. Reverse Transkription (RT) 28
3.2.8.2. Polymerase Kettenreaktion (PCR) 29
3.2.9. Agarosegelelektrophorese 29
3.2.10. Gewinnung und Reinigung der cDNA 30
3.2.11. cDNA Klonierung 31
3.2.12. Präparation von Plasmid DNA 31
3.2.13. Restriktionsenzymverdau 32
3.2.14. DNA Sequenzierung 32
3.2.14.1. Sequenzierungsreaktion 32
3.2.14.2. Auftrennung von DNA im Sequenzgel 33
3.2.15. Auswertung der Sequenzdaten 34
3.2.16. Genbank Accession Nummern 34
3.2.17. Phylogenetische Analyse 35
3.2.18. Herstellung der Antiseren 36
3.2.18.1. Herkunft und Haltung der Schafe 36
3.2.18.2. Viruspräparation für die Immunisierung 36
3.2.18.3. Immunisierung 36
3.2.18.4. Blutentnahme und Gewinnung der Antiseren 37
3.2.19. Serumneutralisationstest 37
3.2.20. Berechnung der antigenetischen Verwandtschaft 37
3.2.21. Clusteranalyse der antigenetischen Verwandtschaft 38
4. ERGEBNISSE 39
4.1. Klonierung und Sequenzierung der kompletten Genome der
Pestivirus Stämme Giraffe 1 undReindeer 1 39
4.1.1. Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion 39
4.1.2. cDNA Klonierung 39
4.1.3. Ermittlung der kompletten Nukleinsäuresequenzen 40
4.2. Charakteristika der Genome von Giraffe 1 und Reindeer 1 44
4.2.1. Vergleich der kompletten Nukleinsäuresequenzen der Pestivirus
Stämme Giraffe 1 und Reindeer 1 mit denen anderer Pestiviren ... 46
4.2.2. Vergleichende Analyse der Polyproteinsequenzen 48
4.2.3. Vergleich der Aminosäuresequenzen des Glykoproteins E2 51
4.3. Phylogenetische Analysen 55
4.3.1. Phylogenetische Analyse auf der Basis kompletter
kodierender Sequenzen 56
4.3.2. Phylogenetische Analysen verschiedener subgenomischer
Bereiche des Pestivirus Genoms 56
4.3.3. Analyse der genetischen Distanzen 59
4.4. Antigenetische Verwandtschaft von Pestiviren 61
4.4.1. Herstellung der Antiseren 61
4.4.2. Kreuzneutralisationstests 61
4.4.3. Antigenetische Verwandtschaft 63
II
Inhaltsverzeichnis
5. DISKUSSION 65
6. ZUSAMMENFASSUNG 71
7. SUMMARY 73
8. LITERATURVERZEICHNIS 75
9. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 100
III
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