Optimierung und Evaluierung eines Capture-ELISA zum Nachweis von Francisella tularensis und Vergleich mit der PCR:
Gespeichert in:
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| Format: | Buch |
| Sprache: | German |
| Veröffentlicht: |
2001
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I
INHALTSVERZEICHNIS
1
EINLEITUNG
1
1.1
ALLGEMEINES
1
1.2
AETIOLOGIE
2
1.2.1
ERREGER
2
1.2.2
EPIDEMIOLOGIE
4
1.2.2.1
ERREGERRESERVOIR
UND
UEBERTRAGUNG
4
1.2.2.2
RISIKOGRUPPE
5
1.2.2.3
VERBREITUNG
6
1.2.2.4
SEUCHENBEWEGUNG
IN
DEUTSCHLAND
BIS
2000
7
1.3
DIE
KRANKHEIT
TULARAEMIE
8
1.3.1
FORMALE
PATHOGENESE
UND
VERLAUF
8
1.3.2
KLINISCHE
MANIFESTATION
8
1.3.2.1
AEUSSERE
TULARAEMIE
9
1.3.2.2
INNERE
TULARAEMIE
10
1.4
DIFFERENTIALDIAGNOSE
11
1.5
THERAPIE
12
1.6
PRAEVENTION
13
1.7
DIAGNOSE
14
1.7.1
KLINIK
UND
BLUTBILD
14
1.7.2
SEROLOGIE
UND
ERREGERNACHWEIS
15
1.8
ZIELSETZUNG
17
2
MATERIAL
UND
METHODEN
18
2.1
CAPTURE
ENZYME
LINKED
IMMUNOSORBENT
ASSAY
(CELISA)
18
2.1.1
PRINZIP
DES
CELISA
18
2.1.2
NACHWEIS
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
LIPOPOLYSACCHARID
19
(LPS)
-
ANTIGEN
MITTELS
CELISA
2.L.2.1
HERSTELLUNG
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
KONTROLLANTIGEN
19
2.1.2.1.1
ANZUCHT
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
19
2.1.2.1.2
HERSTELLUNG
EINER
BAKTERIENSTAMMLOESUNG
19
2.1.2.1.3
PROBENAUFBEREITUNG
DURCH
EXTRAKTION
VON
LPS
-
ANTIGEN
20
2.1.3
HERSTELLUNG
UND
VALIDIERUNG
DER
POSITIVKONTROLLSERIE
AUS
LPS
20
2.
1.3.1
HERSTELLUNG
DER
POSITIVKONTROLLSERIE
(EICHKURVE)
20
2.1.3.2
BESTIMMUNG
DER
INTRA-ASSAY-VARIANZ
21
2.1.3.3
BESTIMMUNG
DER
INTER-ASSAY-VARIANZ
21
2.1.4
SPEZIFISCHE
MONOKLONALE
ANTIKOERPER
GEGEN
LPS
VON
FRANCISELLA
21
TULARENSIS
2.1.4.1
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
FT-27
22
2.1.4.2
MONOKLONALER
ANTIKOERPER
FT-11-POD
22
2.1.S
STANDARD
METHODE
CELISA
22
2.1.5.1
TESTBEDINGUNGEN
22
2.1.5.2
BELEGUNG
DER
MIKROTITERPLATTEN
23
2.1.5.3
DURCHFUEHRUNG
DES
CELISA
24
2.1.6
OPTIMIERUNG
DER
METHODE
DES
CELISA
26
2.1.6.1
KONZENTRATIONSBESTIMMUNG
DES
ANTIKOERPERS
FT-27
26
2.1.6.2
OPTIMIERUNG
VON
INKUBATIONSZEIT
UND
-TEMPERATUR
DER
26
PLATTENBESCHICHTUNG
2.
1
.6.3
OPTIMIERUNG
DER
LPS
-
EXTRAKTIONSZEITEN
UND
-TEMPERATUREN
26
2.1.7
DURCHFUEHRUNG
DES
CELISA
MIT
PROBENMATERIAL
27
2.1.7.1
PROBENMATERIAL
27
2.1.7.2
BESTIMMUNG
DER
NULLSTANDARDS
(LEERWERTE)
VON
PROBENMATRIZES
28
UND
PBS
2.1.7.3
VERSETZEN
DES
PROBENMATERIALS
MIT
BAKTERIEN
UND
LPS
VON
28
FRANCISELLA
TULARENSIS
2.2
DIE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
30
2.2.1
PRINZIP
DER
PCR
30
2.2.2
ARBEITSMETHODEN
ZUR
VERMEIDUNG
VON
KONTAMINATION
DER
PCR
32
2.2.3
NACHWEIS
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
16S
RRNA-GENSEQUENZEN
33
MITTELS
PCR
2.2.3.1
HERSTELLUNG
VON
PROBEN
DURCH
LPS
-
EXTRAKTION
33
2.2.3.1.1
BAKTERIEN-UEBERSTAENDE
AUS
REINKULTUREN
33
2.2.3.1.2
ARTIFIZIELL
VERSETZTES
PROBENMATERIAL
34
2.2.4
EXTRAKTION
VON
PROBEN
MIT
LYSISPUFFER
UND
PROTEINASE
K
34
2.2.4.1
POSITIVKONTROLLSERIE
AUS
REINKULTUREN
34
2.2.4.2
DNA-PROBEN
AUS
ARTIFIZIELL
VERSETZTEM
PROBENMATERIAL
35
2.2.5
PCR
-
REAKTIONSANSATZ
35
2.2.6
PCR
-
AMPLIFIKATION
37
2.2.7
NACHWEIS
DER
AMPLIFIKATIONSPRODUKTE
38
3.
ERGEBNISSE
39
3.1
NACHWEIS
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
-
ANTIGEN
MITTELS
CELISA
39
3.1.1
BESTIMMUNG
OPTIMALER
TESTBEDINGUNGEN
39
3.1.1.1
BESCHICHTUNGSKONZENTRATION
DES
ANTIKOERPERS
FT-27
39
3.1.1.2
INKUBATIONSZEIT
UND
-TEMPERATUR
FUER
DIE
BESCHICHTUNG
MIT
40
ANTIKOERPER
FT-27
3.1.1.3
EINFLUSS
DER
EXTRAKTIONSZEIT
UND
-TEMPERATUR
AUF
DIE
SOLUBILISIERUNG
41
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
-
LPS
3.1.2
FESTLEGUNG
DER
TESTVARIANTE
DES
CELISA
42
3.1.2.1
BESTIMMUNG
DER
UNTEREN
NACHWEISGRENZE
(CUT-OFF)
42
3.1.2.2
HERSTELLUNG
DER
POSITIVKONTROLLSERIE
(EICHKURVE)
43
3.1.2.3
BESTIMMUNG
DER
INTRA
UND
INTER-ASSAY-VARIANZ
44
3.1.2.4
BESTIMMUNG
DES
DYNAMISCHEN
MESSBEREICHS
(PRAEZISION)
46
III
3.1.3
NACHWEIS
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
IN
PROBENMATERIAL
47
3.1.3.1
NACHWEISGRENZE
IN
ARTIFIZIELL
VERSETZTEM
PROBENMATERIAL
47
3.1.3.2
WIEDERFINDUNG
VON
BAKTERIENKONZENTRATIONEN
IM
PROBENMATERIAL
50
3.2
AMPLIFIKATION
VON
FRANCISELLA
TULARENSIS
16S
RRNA
-
GENSEQUENZEN
53
3.2.1
KONTROLLEN
53
3.2.2
DNA-PROBEN
AUS
DEN
ANSAETZEN
FUER
DEN
CELISA
53
3.2.2.1
NACHWEISGRENZE
IN
AUS
REINKULTUREN
GEWONNENEN
DNA-PROBEN
53
3.2.2.2
LPS
UND
BAKTERIEN-UEBERSTAENDE
AUS
ARTIFIZIELL
VERSETZTEM
53
PROBENMATERIAL
3.2.3
EXTRAKTION
VON
PROBEN
MIT
LYSISPUFFER
UND
PROTEINASE
K
54
3.2.3.1
NACHWEISGRENZE
IN
AUS
REINKULTUREN
GEWONNENEN
DNA-PROBEN
54
3.2.3.2
NACHWEISGRENZE
IN
AUS
ARTIFIZIELL
VERSETZTEM
PROBENMATERIAL
55
GEWONNENEN
DNA
PROBEN
4.
DISKUSSION
57
4.1
DIAGNOSE
DER
TULARAEMIE
57
4.2
CELISA
UND
PCR
ALS
DIAGNOSTISCHE
ALTERNATIVEN
58
4.2.1
BESTIMMUNG
OPTIMALER
TESTBEDINGUNGEN
DES
CELISA
59
4.2.2
FESTLEGUNG
DER
TESTVARIANTE
DES
CELISA
60
4.2.3
SENSITIVITAET
UND
UNTERE
NACHWEISGRENZE
BEI
UNTERSUCHUNG
DES
64
ARTIFIZIELL
VERSETZTEN
PROBENMATERIALS
4.2.4
WIEDERFINDUNG
VON
BAKTERIENKONZENTRATIONEN
IM
CELISA
68
4.2.5
SPEZIFITAET
DES
CELISA
UND
DER
16S
RRNA-PCR
68
43
VERGLEICH
MIT
ERGEBNISSEN
IN
DER
LITERATUR
70
4.4
SCHLUSSFOLGERUNG
UND
AUSBLICK
71
5
ZUSAMMENFASSUNG
72
6
LITERATUR
74
7
ANHANG
88
7.1
MATERIAL
88
7.1.1
LOESUNGEN
UND
MATERIALIEN
FUER
DEN
CELISA
88
7.1.2
LOESUNGEN
UND
MATERIALIEN
FUER
DIE
PCR
89
8
DANKSAGUNG
91 |
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