Vergleichende Charakterisierung zweier CYP2D-Enzyme:
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2002
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adam_text | VERGLEICHENDE CHARAKTERISIERUNG ZWEIER CYP2D-ENZYME DISSERTATION ZUR
ERLANGUNG DES DOKTORGRADES DER MATHEMATISCH-NATURWISSENSCHAFTLICHEN
FAKULTAET DER CHRISTIAN-ALBRECHTS-UNIVERSITAET ZU KIEL VORGELEGT VON
KIRSTIN BERGER KIEL 2002 INHALTSVERZEICHNIS 1 EINFUEHRUNG 1 1.1
BIOTRANSFORMATION 1 1.1.1 DEFINITION UND BEDEUTUNG 1 1.1.2 BETEILIGTE
ENZYME 3 1.1.2.1 VORKOMMEN UND UEBERSICHT 3 1.1.2.2 DAS CYTOCHROM P450
ENZYMSYSTEM 4 1.1.3 BIOTRANSFORMATION STICKSTOFFHALTIGER FUNKTIONELLER
GRUPPEN 8 1.1.3.1 UEBERBLICK 8 1.1.3.2 BENZAMIDOXIM-REDUKTASE-SYSTEM 13
1.1.3.2.1 KOMPONENTEN DES BENZAMIDOXIM-REDUKTASE-SYSTEMS 13 1.1.3.2.2
BISHERIGE UNTERSUCHUNGEN 14 1.1.4 VITAMIN D 3 16 1.1.4.1 BEDEUTUNG UND
STOFFWECHSELGESCHEHEN 16 1.1.4.2 VITAMIN D 3 25-HYDROXYLASEN - BISHERIGE
UNTERSUCHUNGEN 17 1.2 ZIELSETZUNG DER VORLIEGENDEN ARBEIT 19 2
UEBEREINSTIMMUNGEN ZWISCHEN BENZAMIDOXIM- REDUKTASE UND VITAMIN D 3
25-HYDROXYLASE 20 2.1 EINLEITUNG 20 2.1.1 BASIS DER UNTERSUCHUNGEN 20
2.1.2 ZIELSETZUNG UND GEPLANTE VORGEHENSWEISE 20 2.2 METHODEN 22 2.2,1
MATERIALIEN 22 2.2.1.1 CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN 22 2.2.1.2
GERAETE 22 2.2.1.3 ALLGEMEINE PUFFER UND LOESUNGEN 23 2.2.1.4 ENZYMQUELLEN
23 2.2.1.4.1 CYTOCHROM B 5 , NADH-CYTOCHROM B 5 -REDUKTASE UND
BENZAMIDOXIM-REDUKTASE 23 2.2.1.4.2 MIKROSOMALE VITAMIN D 3
25-HYDROXYLASE UND NADPH-CYTOCHROM P450- REDUKTASE 24 2.2.1.4.3
GEHALTSBESTIMMUNGEN DER VORLIEGENDEN ISOLIERTEN KOMPONENTEN 24
INHALTSVERZEICHNIS 2.2.1.5 VERWENDETE ORGANISMEN 25 2.2.2 METHODEN 25
2.2.2.1 BIOCHEMISCHE METHODEN 25 2.2.2.1.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH DER
BCA-METHODE 25 2.2.2.1.2 BESTIMMUNG DES CYTOCHROM P450-GEHALTS 25
2.2.2.1.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE(SDS-PAGE) 26 2.2.2.1.4
FAERBUNG MIT COOMASSIE BRILLANT BLUE R 250 27 2.2.2.1.5
WESTERN-BLOT-ANALYSE 27 2.2.2.1.6 ELISA 28 2.2.2.2 HERSTELLUNG
MONOKLONALER ANTIKOERPER 29 2.2.2.2.1 MYELOMZELLKULTUR 29 2.2.2.2.2
GEWINNUNG DER B-LYMPHOCYTEN 29 2.2.2.2.3 FUSION 30 2.2.2.2.4
HYBRIDOMZELLEN, IHRE SELEKTION UND KLONIERUNG 30 2.2.2.2.5 DAUERKULTUR
DER MAK-SEZERNIERENDEN HYBRIDOMZELLEN UND ERNTE DES UEBERSTANDES 31
2.2.2.2.6 IDENTIFIZIERUNG DER ANTIKOERPERKLASSE 31 2.2.2.3
AKTIVITAETSBESTIMMUNGEN DER VITAMIN D 3 25-HYDROXYLASE UND DER
BENZAMIDOXIM-REDUKTASE 32 2.2.2.3.1 BENZAMIDOXIM-REDUKTASE-ASSAY 32
2.2.2.3.2 ASSAY FUER DIE 25-HYDROXYLIERUNG VON VITAMIN D 3 UND 1
A-HYDROXYVITAMIN D 3 32 2.3 ERGEBNISSE 33 2.3.1 GEGENUEBERSTELLUNG DER
PRIMAERSTRUKTUREN DER BENZAMIDOXIM- REDUKTASE UND DER VITAMIN D 3
25-HYDROXYLASE 33 2.3.2 GEWINNUNG MONOKLONALER ANTIKOERPER 34 2.3.2.1
SELEKTION ANTIKOERPERSEZERNIERENDER HYBRIDOMA-KLONE 34 2.3.2.1.1
IDENTIFIZIERUNG DER ANTIKOERPERKLASSE 36 2.3.2.1.2 GEWINNUNG VON
UEBERSTAENDEN UND UEBERPRUEFUNG DER STABILEN / ANTIKOERPEREXPRESSION 37 2.3.3
KREUZREAKTIVITATEN 37 2.3.4 ENZYMAKTIVITAETEN 38 2.4 DISKUSSION 40 2.4.1
BETRACHTUNG DER PRIMAERSTRUKTUREN VERSCHIEDENER CYP2D-ENZYME 40 2.4.2
BEURTEILUNG DER ANTIGEN-ANTIKOERPER-REAKTIONEN 42 2.4.3
SUBSTRATSPEZIFITAETEN 42 2.4.4 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 44
INHALTSVERZEICHNIS 3 KLONIERUNG UND EXPRESSION EINES CYP2D-ENZYMS 45 3.1
EINLEITUNG 45 3.1.1 BIOTRANSFORMATIONSSTUDIEN 45 3.1.1.1 BIOLOGISCHE
MODELLE FUER BIOTRANSFORMATIONSSTUDIEN 45 3.1.1.2 KLONIERTE UND
EXPRIMIERTE P450-ENZYME 46 3.1.2 GEWINNUNG DER GENETISCHEN INFORMATION
FUER EIN PROTEIN 47 3.1.2.1 VERWENDUNG EINER CDNA-BANK 47 ZA.2.2 DIREKTE
ISOLIERUNG DER GENETISCHEN INFORMATION AUS EINEM ORGAN 47 3.1.3
BAKTERIELLE GENEXPRESSION 48 3.1.3.1 ALLGEMEINE EINFUEHRUNG 48 3.1.3.2
EINSATZ BEI DER EXPRESSION VON P450-ENZYMEN 48 3.1.4 DAS SV40/COS-SYSTEM
49 3.1.4.1 ALLGEMEINE EINFUEHRUNG 49 3.1.4.2 EINSATZ BEI DER EXPRESSION
VON P450-ENZYMEN 50 3.1.5 DAS BACULOVIRUS-EXPRESSIONS-SYSTEM (BVES) 51
3.1.5.1 ALLGEMEINE EINFUEHRUNG 51 3.1.5.2 EINSATZ BEI DER EXPRESSION VON
P450-ENZYMEN 53 3.1.6 ZIELSETZUNG 53 3.2 METHODEN 54 3.2.1 MATERIALIEN
54 3.2.1.1 CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN 54 3.2.1.2 ENZYME 54
3.2.1.3 GERAETE 54 3.2.1.4 ALLGEMEINE PUFFER UND MEDIEN 55 3.2.1.5
VERWENDETE ORGANISMEN 56 3.2.1.6 VEKTOREN UND PLASMIDE 56 3.2.1.7
SYNTHETISCHE OLIGONUKLEOTIDE 57 3.2.2 METHODEN 58 3.2.2.1 BIOCHEMISCHE
METHODEN 58 3.2.2.2 ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 58
3.2.2.2.1 POLYMERASE-KETTEN-REAKTION (PCR) 58 3.2.2.2.2 NICK-TRANSLATION
59 INHALTSVERZEICHNIS 3.2.2.2.3 HYBRIDISIERUNGSMETHODEN 60 3.2.2.2.4
BERECHNUNG DER STRINGENTEN TEMPERATUR 61 3.2.2.2.5 IN-VITRO-MUTAGENESE
(DUT /UNG -METHODE) 61 3.2.2.2.6 DNA-SEQUENZIERUNG 62 3.2.2.2.7
SOUTHERN-BLOT-ANALYSE 63 3.2.2.3 ISOLIERUNG GENETISCHER INFORMATION AUS
SCHWEINELEBER 63 3.2.2.3.1 PRAEPARATION VON GESAMT-RNA AUS DER
SCHWEINELEBER 63 3.2.2.3.2 MRNA-LSOLIERUNG 64 3.2.2.3.3 CDNA-SYNTHESE 64
3.2.2.4 ISOLIERUNG EINER CDNA MIT HILFE EINER
^.-PHAGEN-EXPRESSIONS-BIBLIOTHEK 65 3.2.2.4.1 SCREENING EINER
LAMBDA-EXPRESSIONS-BIBLIOTHEK MIT ANTIKOERPERN 65 3.2.2.4.2
DNA-PRAEPARATION AUS .-PHAGEN 66 3.2.2.5 EXPRESSIONSEXPERIMENTE IN
BAKTERIEN ( COLI) 67 3.2.2.5.1 BAKTERIELLE ELEKTROPORATION 67 3.2.2.5.2
BAKTERIELLE CACI 2 -TRANSFORMATION 68 3.2.2.5.3 EXPRESSION 68 3.2.2.5.4
LOKALISATION EXPRIMIERTER PROTEINE INNERHALB DER ZELLE 69 3.2.2.5.5
NACHWEIS DES EXPRIMIERTEN PROTEINS IN INCLUSION BODIES 70 3.2.2.6
EXPRESSIONSEXPERIMENTE IM SV40/COS-SYSTEM 70 3.2.2.6.1 KULTIVIERUNG VON
COS-7 ZELLEN 70 3.2.2.6.2 TRANSFEKTION VON COS-7 ZELLEN DURCH
LIPOFEKTION 71 3.2.2.6.3 ANLEGEN VON DMSO-STOCKS 71 3.2.2.7
EXPRESSIONSEXPERIMENTE IM BACULOVIRUS/SF9-SYSTEM 71 3.2.2.7.1
KULTIVIERUNG VON SPODOPTERA FRUGIPERDA (SF9)-ZELLEN 71 3.2.2.7.2
COTRANSFEKTION VON SF9-ZELLEN 72 3.2.2.7.3 PLAQUETEST 73 3.2.2.7.4
AUFBEREITUNG VON SF9-ZELLEN FUER DIE SDS-PAGE 73 3.2.2.7.5
DNA-PRAEPARATION AUS INSEKTENZELLEN 74 3.3 ERGEBNISSE 75 3.3.1
EXPERIMENTE ZUR GEWINNUNG DER GENETISCHEN INFORMATION DER
BENZAMIDOXIM-REDUKTASE UND DER VITAMIN D 3 25-HYDROXYLASE 75 3.3.1.1
SCREENING DER CDNA-EXPRESSIONS-BANK 75 3.3.1.2 CDNA-LSOLIERUNG AUS
SCHWEINELEBER 78 3.3.1.3 AMPLIFIKATIONSVERSUCHE UEBER PCR AN SPEZIFISCHER
CDNA 79 3.3.2 KLONIERUNG DER CDNA DER VITAMIN D 3 25-HYDROXYLASE 79
3.3.3 EXPRESSION VON CYP2D25 -FRAGMENTEN IN E. COLI 82 IV
INHALTSVERZEICHNIS 3.3.3.1 KONSTRUKTION DER EXPRESSIONSVEKTOREN
PET-22B(+)/CYP2D25 -HIND/3REV UND PET-22B(+)/CYP2D25 -NCO/3REV 82
3.3.3.2 EXPRESSION DER BEIDEN CYP2D25 -FRAGMENTE NCO/3REV UND HIND/3REV
83 3.3.3.3 LOKALISATION DES EXPRIMIERTEN PROTEINS INNERHALB DER ZELLE 84
3.3.4 EXPRESSION IM SV40/COS-SYSTEM 86 3.3.4.1 KONSTRUKTION DES
EXPRESSIONSPLASMIDS PEGFP-N1/CYP2D25 -3FOR/3REV 86 3.3.4.2 TRANSFEKTION
VON COS-7 ZELLEN UND UEBERPRUEFUNG DER EXPRESSION 86 3.3.5 EXPRESSION IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM 88 3.3.5.1 GEPLANTE STRATEGIEN 88 3.3.5.2
KONSTRUKTION DES TRANSFERPLASMIDS PVL1393/CYPN 89 3.3.5.3 KONSTRUKTION
DER TRANSFERPLASMIDE PACG2T/BAC1/3 UND PACG2T/BAC2/3 90 3.3.5.4
HERSTELLUNG REKOMBINANTER VIREN DURCH HOMOLOGE REKOMBINATION 91 3.4
DISKUSSION 94 3.4.1 CDNA-ISOLIERUNG AUS EINER
K-PHAGEN-EXPRESSION-BLBLIOTHEK 94 3.4.2 ISOLIERUNG UND KLONIERUNG DER
CYP2D25 -CDNA 95 3.4.3 EXPRESSION VON CYP2D25 -FRAGMENTEN IN E. COLI 96
3.4.4 CYP2D25 -EXPRESSION IM SV40/COS-SYSTEM 97 3.4.5
CYP2D25 -EXPRESSION IM BACULOVIRUS-EXPRESSIONSSYSTEM 98 3.4.6
ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 100 4 CHARAKTERISIERUNG DER IM
BACULOVIRUS-EXPRESSIONS- SYSTEM EXPRIMIERTEN PROTEINE 101 4.1 EINLEITUNG
10 1 4.1.1 T CHARAKTERISIERUNG EXPRIMIERTER PROTEINE 101 4.1.2
UNTERSUCHUNGEN ZUR STRUKTUR VON CYTOCHROM P450-ENZYMEN 101 4.1.3
ZIELSETZUNG 102 4.2 METHODEN 102 4.2.1 MATERIALIEN 102 4.2.1.1
CHEMIKALIEN UND SONSTIGE MATERIALIEN 102 4.2.1.2 GERAETE 103 4.2.1.3
ENZYMQUELLEN 103 V INHALTSVERZEICHNIS 4.2.2 METHODEN 103 4.2.2.1
BIOCHEMISCHE METHODEN 103 4.2.2.2 ERMITTLUNG DES OPTIMALEN
ERNTEZEITPUNKTES - ZEITREIHE 103 4.2.2.3 EXPRESSION DER REKOMBINANTEN
PROTEINE IN SF9-SCHUETTELKULTUREN 104 4.2.2.3.1 HERSTELLUNG VON
HIGH-TITER-VIRUSSTOCKS 104 4.2.2.3.2 EXPRESSIONSBEDINGUNGEN 104 4.2.2.4
HERSTELLUNG VON MIKROSOMEN AUS INFIZIERTEN SF9-KULTUREN 105 4.2.2.5
AKTIVITAETSBESTIMMUNG IM VITAMIN D 3 25-HYDROXYLASE-ASSAY 105 4.2.2.5.1
INKUBATIONSBEDINGUNGEN 105 4.2.2.5.2 PROBENAUFBEREITUNG 106 4.2.2.5.3
HOCHLEISTUNGSFLUESSIGCHROMATOGRAPHIE 106 4.3 ERGEBNISSE 107 4.3.1
ZEITREIHEN ZUR BESTIMMUNG OPTIMALER ERNTEZEITPUNKTE 107 4.3.2
MLKROSOMENFRAKTIONEN 108 4.3.2.1 NACHWEIS DER EXPRIMIERTEN PROTEINE 108
4.3.2.2 P450-GEHALT DER MIKROSOMENFRAKTIONEN 109 4.3.3 AKTIVITAETEN IM
VITAMIN D 3 25-HYDROXYLASE-ASSAY 111 4.3.3.1 KALIBRIERUNG UND
WIEDERFINDUNG 111 4.3.3.2 UMSETZUNGSRATEN 112 4.4 DISKUSSION 114 4.4.1
ERNTEZEITPUNKTE . 114 4.4.2 EXPRESSIONS-UND AUFARBEITUNGSBEDINGUNGEN 114
4.4.3 CHARAKTERISIERUNG EXPRIMIERTER PROTEINE 115 4.4.3.1
CO-DIFFERENZSPEKTREN DER MIKROSOMENPRAEPARATIONEN 115 4.4.3.2 1 3
25-HYDROXYLIERUNG 116 I 4.4.4 STRUKTUR-FUNKTIONALITAETS-BEZIEHUNGEN 117
4.4.5 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK 118 5 ZUSAMMENFASSUNG 120 6
LITERATURVERZEICHNIS 122 VI
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