Störungen des cytoplasmatischen Cholesterolstoffwechsels: Identifizierung differentiell exprimierter Genprodukte mit Hilfe der subtraktiven Hybridisierung und Charakterisierung eines Proteins unbekannter Funktion
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
SEITE
1.
EINLEITUNG
.
1
1.1.
GENEXPRESSION
.
1
1.1.1.
AUFBAU
DES
HUMANEN
GENOMS
.
1
1.1.2.
DIE
TRANSKRIPTION:
EIN
KURZER
UEBERBLICK
.
.
1
1.1.3.
BEDEUTUNG
DER
GENEXPRESSION
.
3
1.2.
METHODEN
ZUR
UNTERSUCHUNG
DER
DIFFERENTIELLEN
GENEXPRESSION
.
3
1.2.1.
DIFFERENTIELLES
SCREENING
.
3
1.2.2.
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
.
4
1.2.3.
DIFFERENTIAL
DISPLAY
.
7
1.2.4.
KOMBINIERTE
METHODEN
.
9
1.2.5.
UEBERBLICK
UEBER
WEITERE
METHODEN
.
10
1.3.
AUSWAHL
DER
GEEIGNETEN
METHODE
.
11
1.4.
KONTROLLE DER
DIFFERENTIELLEN
EXPRESSION
.
12
1.5.
ZIELSETZUNG DER
ARBEIT
.
13
2.
MATERIAL
UND
METHODEN
.
14
2.1.
MATERIALIEN
.
14
2.1.1.
CHEMIKALIEN
UND
SONSTIGE
REAGENZIEN
.
14
2.1.2.
GERAETE
.
14
2.1.3.
ENZYME
.
15
2.1.4.
PLASMIDVEKTOREN
.
15
2.1.4.1.
PBLUESCRIPT
IIKS
(+)
.
15
2.I.4.2.
TOPO
TA
CLONING-VEKTOREN
.
15
2.I.4.3.
QIAEXPRESSPQE-VEKTOREN
.
16
2.1.5.
BAKTERIENSTAEMME
.
16
2.1.6.
KULTURMEDIEN
FUER
BAKTERIEN
.
16
2.1.7.
GENBANK
.
17
2.1.8.
ZELLINIEN
.
17
2.1.9.
ZELLKULTURMEDIEN
.
17
2.1.10.
QLIGONUKLEOTIDE
.
17
2.2.
METHODEN
.
18
2.2.1.
STANDARDVERFAHREN
.
18
2.2.2.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
DNA
.
18
2.2.3.
ISOLIERUNG
DER
GESAMT-RNA
.
18
2.2.3.1.
ISOLIERUNG
MIT
TRIZOL
.
18
2.2.3.2.
ISOLIERUNG
HOCHREINER
GESAMT-RNA
.
18
2.2.4.
ISOLIERUNG
DER
MESSENGER-RNA
.
18
2.2.5.
SYNTHESE
DER
KOMPLEMENTAEREN
DNA
(CDNA)
.
18
2.2.6.
POLYMERASE-KETTENREAKTION
(PCR)
.
19
2.2.6.1.
STANDARDPROTOKOLL
FUER
PCR-REAKTIONEN
.
20
2.2.6.2.
VERWENDETE
OLIGONUKLEOTID-PRIMER
.
20
2.2.7.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
DNA-FRAGMENTE
.
21
2.2.8.
HYDROLYTISCHE
SPALTUNG
DER
DNA
MIT
RESTRIKTIONSENDONUKLEASEN
.
21
2.2.9.
KLONIERUNG
DER
DNA-FRAGMENTE
.
22
2.2.9.1.
PRAEPARATION
DER
PLASMIDVEKTOREN
.
22
2.2.9.2.
LIGATION
.
22
2.2.9.3.
DIREKTE
KLONIERUNG
DER
PCR-PRODUKTE
.
23
2.2.10.
TRANSFORMATION
KOMPETENTER
BAKTERIEN
.
23
2.2.11.
ISOLIERUNG
UND
REINIGUNG
DER
PLASMID-DNA
.
24
2.2.11.1.
ISOLIERUNG
KLEINER
MENGEN
PLASMID-DNA
(MINIPREP)
.
24
2.2.11.2.
ISOLIERUNG
DER
PLASMID-DNA
IM
GROSSEN
MASSSTAB
.
24
2.2.12.
DNA-SEQUENZIERUNG
.
24
2.2.13.
RADIOAKTIVE
MARKIERUNG
DER
DNA-FRAGMENTE
.
25
2.2.14.
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
UND
DETEKTION
DIFFERENTIELL
EXPRIMIERTER
GENE
.
26
2.2.15.
SCREENING
EINER
GENBANK
.
27
2.2.15.1.
ISOLIERUNG
GENOMISCHER
KLONE
.
27
2.2.15.2.
DNA-ISOLIERUNG
AUS
%-PHAGEN
.
28
2.2.15.3.
KLONIERUNG
UND
SEQUENZIERUNG
.
28
2.2.16.
IDENTIFIZIERUNG
DER
5
'
UND
3
'
-ENDEN
EINER
MRNA
.
29
2.2.16.1.
REVERSE
TRANSKRIPTION
DER
CAP-STRUKTUR
.
29
2.2.16.2.
IDENTIFIZIERUNG
DES
3
'
-ENDES
DURCH
3
'
-RACE
.
29
2.2.17.
NORTHERN
BLOT
.
29
2.2.18.
PROTEINISOLIERUNG
AUS
FIX
D8-EXPRIMIERENDEN
BAKTERIEN
.
30
-II
2.2.19.
ZELLKULTUR
.
31
2.2.19.1.
AUSSAEEN
VON
ZELLEN
UND
ZELLKULTIVIERUNG
.
31
2.2.19.2.
TRYPSINIERUNG
.
31
2.2.19.3.
KRYOKONSERVIERUNG
.
32
2.2.20.
TRANSFEKTION
.
32
2.2.21.
LIPASE-ENZYMAKTIVITAETSTEST
.
33
2.2.21.1.
ERNTEN
DER
ZELLEN
UND
HERSTELLUNG
DER
ZELLEXTRAKTE
.
33
2.2.21.2.
BESTIMMUNG
DER
LIPASE-ENZYMAKTIVITAET
.
33
2.2.22.
QUANTITATIVE
POLYMERASE-KETTENREAKTION
.
34
3.
ERGEBNISSE
.
36
3.1.
SUBTRAKTIVE
HYBRIDISIERUNG
UND
DIFFERENTIELLES
SCREENING
.
36
3.1.1.
VERSUCH
1:
293-HLAL
VERSUS
293
.
37
3.1.2.
VERSUCH
2:
W-FIBROBLASTEN
VERSUS
N-FIBROBLASTEN
.
38
3.1.3.
VERSUCH3:
W-FIBROBLASTEN
+
SIMVASTATIN
VERSUSN-FIBROBLASTEN
.
39
3.1.4.
VERSUCH
4:
FIX
D8-293
VERSUS
ANTI
D8-293
.
40
3.2.
AUSWAHL
VON
FIX
D8
ALS
KANDIDATENGEN
.
40
3.3.
GENERIERUNG
DER
VOLLSTAENDIGEN
FIX
D8-CDNA
.
41
3.4.
GENBANK-SCREENING
UND
GENOMISCHE
STRUKTUR
.
41
3.5.
IDENTIFIZIERUNG DER
EXON-INTRON-GRENZEN
.
43
3.6.
NORTHERN
BLOT
.
43
3.7.
IDENTIFIZIERUNG
DES
5
'
-ENDES
DER
FIX
D8-CDNA
.
44
3.8.
IDENTIFIZIERUNG
DES
3
'
-ENDES
DER
FIX
D8-CDNA
.
45
3.9.
UNTERSUCHUNG
DER
5*
-FLANKIERENDEN
SEQUENZ
DES
FIX
D8-GENS
.
46
3.10.
UNTERSUCHUNG
DER
GENEXPRESSION
.
47
3.10.1.
GEWEBSSPEZIFISCHE
EXPRESSION
DES
FIX
D8-GENS
.
47
3.10.2.
QUANTITATIVE
RT-PCR
.
47
3.11.
CHARAKTERISIERUNG
DES
FIX
D8-PROTEINS
.
48
3.11.1.
LOKALISATION
DES
FIX
D8-PROTEINS
IN
DER
ZELLE
.
48
3.11.2.
BESTIMMUNG
DER
PROTEINMASSE
.
50
3.11.3.
HOMOLOGIEN
.
50
3.11.4.
ISOLIERUNG
DES
FIX
D8-PROTEINS
.
50
-III
3.12.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
VON
FIX
D8
.
51
3.12.1.
LIPASE-ENZYMAKTIVITAETSTEST
.
52
3.12.2.
FIX
D8-UEBEREXPRIMIERENDE
ZELLEN
.
52
3.12.3.
HEMMUNG
DER
FIX
D8-EXPRESSION
.
53
4.
DISKUSSION
.
54
4.1.
DIFFERENTIELLE
GENEXPRESSION
IN
ZELLEN
MIT
STOERUNGEN
DER
ZELLULAEREN
CHOLESTEROLHOMOEOSTASE
.
54
4.1.1.
REGULATION
DER
ZELLULAEREN
CHOLESTEROLHOMOEOSTASE
.
54
4.1.2.
ERKRANKUNGEN
ALS
FOLGE
EINER
STOERUNG
DER
INTRAZELLULAEREN
CHOLESTEROL
HOMOEOSTASE
.
55
4.1.3.
MODELLE
FUER
STOERUNGEN
DER
CHOLESTEROLHOMOEOSTASE
.
55
4.2.
INTERPRETATION
DER
ERGEBNISSE
DER
SUBTRAKTIVEN
HYBRIDISIERUNG
.
56
4.2.1.
AUSWIRKUNGEN
DER
HLAL-UEBEREXPRIMIERUNG
AUF
DIE
GENEXPRESSION
.
57
4.2.2.
GENEXPRESSION
IN
WOLMAN-FIBROBLASTEN
.
58
4.2.3.
AUSWIRKUNGEN
DER
HEMMUNG
DER
CHOLESTEROLBIOSYNTHESE
IN
WOLMAN
FIBROBLASTEN
.
59
4.2.4.
BEURTEILUNG
DER
METHODE
.
60
4.3.
FIX
D8:
GENOMISCHE
STRUKTUR
UND
BESONDERHEITEN
DER
MRNA
.
61
4.3.1.
GENOMISCHE
STRUKTUR
VON
FIX
D8
.
61
4.3.2.
ALTERNATIVE
POLYADENYLIERUNG
.
62
4.4.
CHARAKTERISTIKA
DES
FIX
D8-PROTEINS
.
65
4.4.1.
PRIMAERSTRUKTUR
UND
DARAUS
ABGELEITETE
EIGENSCHAFTEN
.
65
4.4.2.
SEQUENZMOTIVE
.
66
4.4.3.
SEKUNDAER
UND
TERTIAERSTRUKTUR
DES
FIX
D8-PROTEINS
.
67
4.5.
UNTERSUCHUNGEN
ZUR
FUNKTION
DES
FIX
D8-PROTEINS
.
67
4.5.1.
FIXD8
ALS
LIPASE
.
67
4.5.2.
DIFFERENTIELLE
GENEXPRESSION
IN
STABIL
TRANSFIZIERTEN
ZELLEN
.
69
4.5.3.
FIX
D8
ALS
STRUKTURPROTEIN
.
69
4.5.4.
FIX
D8
UND
ANGIOGENESE
.
70
4.5.5.
FIX
D8
IN
VERWANDTEN
SPEZIES
.
71
-IV
5.
ZUSAMMENFASSUNG
.
73
6.
ANHANG
.
75
6.1.
SEQUENZ
DER
FIX
D8-CDNA
.
75
6.2.
AMINOSAEURESEQUENZ
DES
FIX
D8-PROTEINS
.
78
6.3.
OLIGON
UKLEOTIDE
.
79
6.3.1.
FIX
D8-SPEZIFISCHE
OLIGONUKLEOTIDE
.
79
6.3.2.
UNSPEZIFISCHE
PRIMER
.
81
6.3.3.
PRIMER
UND
SONDEN
FILR
DEN
TAQMANYY-PCR-ASSAY
.
82
6.3.3.1.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
VON
FIX
D8
.
82
6.3.3.2.
QUANTITATIVE
BESTIMMUNG
DER
18S-RRNA
.
82
7.
LITERATURVERZEICHNIS
.
83
8.
GLOSSAR
.
89
9.
DANKSAGUNG
.
91
10.
TABELLARISCHER
LEBENSLAUF
.
92
-V |
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