Ein genetischer Screen zur Isolierung und Charakterisierung circadian regulierter Gene aus Drosophila melanogaster:
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2002
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INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG
4
1.1 VORBEMERKUNG.4
1.2 DAS CIRCADIANE SYSTEM VON
DROSOPHILA MELANOGASTER.6
1.3 STRATEGIEN ZUR IDENTIFIZIERUNG NEUER UHR-KOMPONENTEN.12
1.4 LUCIFERASE ALS REPORTER RHYTHMISCHER GENEXPRESSION. 14
2 MATERIAL UND METHODEN.17
2.1 MATERIAL. 17
2.1.1 CHEMIKALIEN, ENZYME UND VERBRAUCHSMATERIALIEN. 17
2.1.2 STANDARDLOESUNGEN UND AUFZUCHTMEDIEN.17
2.1.3 OLIGONUKLEOTIDE.18
2.1.4 FLIEGENSTAEMME.19
2.1.5 ANTIKOERPER. 19
2.2 METHODEN. 20
2.2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN (NUKLEINSAEUREN). 20
2.2.1.1 KLONIERUNGEN.20
2.2.1.1.1 VERDAU VON DNA MIT RESTRIKTIONSENZYMEN.20
2.2.1.1.2 REINIGUNG VON DNA AUS AGAROSEGELEN.20
2.2.1.1.3 LIGATION VON DNA.20
2.2.1.1.4 KOMPETENTE ZELLEN UND TRANSFORMATION.21
2.2.1.1.5 PLASMID MINI-PRAEPARATION.21
2.2.1.2 HERSTELLUNG DES /UC-SN/FFER-KONSTRUKTS.21
2.2.1.3 REVERSE TRANSKRIPTION. 22
2.2.1.4 POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). 22
2.2.1.5 SOUTHERN HYBRIDISIERUNG.22
2.2.1.6 QUANTITATIVE RNA-NACHWEISE.23
2.2.1.6.1 NORTHERN BLOT.23
2.2.1.6.2 RNASE PROTECTION ASSAY (RPA).24
2.2.1.7 PLASMID RESCUE.26
2.2.1.8 SEQUENZIERUNGEN. 26
2.2.2 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN.27
2.2.2.1 WESTERN BLOTS. 27
2.2.2.2 NAD KINASE-AKTIVITAETSMESSUNGEN.28
2.2.3 IMMUNHISTOCHEMIE. 30
2.2.4 HERSTELLUNG EINES
TIM03 UND LUC-SNIFFER ENTHALTENDEN REKOMBINANTEN
CHROMOSOMS.31
2.2.5
IN VIVO-BIOLUMINESZENZMESSUNG. 32
2.2.6 VERHALTENSANALYSEN.33
2.2.7 SEQUENZANALYSE UND DATENBANKSUCHE. 34
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
HTTP://D-NB.INFO/965381277
3 ERGEBNISSE
36
3.1 ENHANCER-TRAP MUTAGENESE.36
3.2 UNTERSUCHUNG DER EINFLUESSE DER INNEREN UHR AUF DIE BIOLUMINES
ZENZRHYTHMEN DER KLASSE I LINIEN.39
3.3 IDENTIFIZIERUNG VON GENEN IN DER UMGEBUNG DER RHYTHMISCH AKTIVEN
REGULATORISCHEN ELEMENTE.48
3.4 VERTEILUNG PUTATIVER ENHANCER-SEQUENZEN FUER RHYTHMISCH AKTI
VIERENDE TRANSKRIPTIONSFAKTOREN IN DER GENOMISCHEN UMGEBUNG
DER KLASSE I
P
INSERTIONSORTE. 54
3.5 IMMUNOLOGISCHE ANALYSE DES LUCIFERASE-EXPRESSIONSMUSTERS IN
AUSGEWAEHLTEN KLASSE I LINIEN.57
3.6 IDENTIFIZIERUNG RHYTHMISCH EXPRIMIERTER GENE.61
3.6.1 UEBERBLICK.,.61
3.6.2
CG13432 (QUASIMODO, QSM).63
3.6.2.1
QUASIMODO CODIERT FUER EIN ZONA PELLUCIDA- (ZP-) DOMAENEN PROTEIN DER
EXTRAZELLULAEREN MATRIX. 63
3.6.2.2 DER QUASIMODO-LOKUS:. 70
3.6.2.3 QUASIMODO IST EIN RHYTHMISCH EXPRIMIERTES GEN UND WIRD VON DER
INNEREN UHR REGULIERT.71
3.6.2.4 QSM1'17 UND QSM05510 SIND ZWEI MUTATIONEN, DIE DURCH DIE
INSERTIONEN
1-17 BWZ. 1(2)05510 VERURSACHT WERDEN.74
3.6.2.5 QUASIMODO MISSEXPRESSION ZEIGT TREIBER- UND
EP-LINIEN-SPEZIFISCHE
EFFEKTE.78
3.6.2.6
QSM1'17 UND QSM05510 SIND HYPOMORPHE ALLELE VON QUASIMODO.80
3.6.2.7 HERSTELLUNG EINES POLYKLONALEN QUASIMODO-SERUMS.84
3.6.2.8 ANALYSE DES RAEUMLICHEN EXPRESSIONSMUSTERS VON QUASIMODO MIT
HILFE DER ENHANCER-TRAP LINIE 1(2)05510 .87
3.6.2.9 DIE SENSITIVITAET DES OLFAKTORISCHEN SYSTEMS IST IN QSM05510
NICHT BEEIN
TRAECHTIGT.91
3.6.2.10 EKTOPISCHE
QUASIMODO EXPRESSION VERAENDERT DAS LOKOMOTORVERHALTEN
IN LD, NICHT ABER IN DD.92
3.6.2.11 AUSWIRKUNGEN VON QUASIMODO MUTATIONEN AUF BG-IUC- UND ENHANCER-
TRAP-VERMITTELTE BIOLUMINESZENZRHYTHMEN.96
3.6.3
CG6145.98
3.6.3.1 DER GENOMISCHE LOKUS VON
CG6145.98
3.6.3.2 CG6145 IST EIN RHYTHMISCH EXPRIMIERTES GEN UND WIRD VON DER
INNEREN
UHR REGULIERT.103
3.6.3.3 REMOBILISIERUNG VON IUC-SNIFFER IN ENHANCER-TRAP LINIE 90-3 UND
ER
ZEUGUNG VON
CG6145 DELETIONSMUTANTEN.105
3.6.3.4 MOLEKULARE ANALYSEN POTENTIELLER CG6145 MUTANTEN.108
3.6.3.5 WEDER CG6145 MISSEXPRESSION NOCH CG6145 MUTATIONEN WIRKEN SICH
AUF DIE CIRCADIANE VERHALTENSAKTIVITAET AUS.112
3.6.3.6 CG6145 CODIERT FUER EINE FUNKTIONELLE NAD KINASE.115
3.6.3.7 DIE NAD KINASE-AKTIVITAET IN KOEPFEN VON Y W FLIEGEN WEIST
CIRCADIANE
OSZILLATIONEN AUF. 118
7
4 DISKUSSION
119
4.1 IDENTIFIZIERUNG RHYTHMISCH AKTIVER REGULATORISCHER ELEMENTE.119
4.2 IDENTIFIZIERUNG RHYTHMISCH EXPRIMIERTER GENE.124
4.3 RHYTHMISCH EXPRIMIERTE GENE IN DER NAEHE DER
LUC-SNIFFER
INSERTIONEN. .
128
4.4 ERZEUGUNG VON MUTATIONEN IN RHYTHMISCH REGULIERTEN GENEN.131
4.4.1 QUASIMODO. .13-1
4.4.2
CG6145.136
5 ZUSAMMENFASSUNG. 142
6 LITERATURVERZEICHNIS. 144
7 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN.158
8 VERZEICHNIS DER TABELLEN
*"M
YY
^4^ * 1 I I
%ASS MASS
IM I \ I #MLA9 LAA* IM* INMIMB I
AAAAAAAAAAAAAAAAABAAAAAAAAWAAAAAAAB*AAAAAABAAAA | OVR
9 ANHANG. 161
10 ERKLAERUNG . 164
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