Genetische Untersuchungen zur Antigenvariation bei den humanen Malariaerregern Plasmodium falciparum und Plasmodium vivax:
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INHALTSVERZEICHNIS
I
INHALTSVERZEICHNIS
ZUSAMMENFASSUNG 1
SUMMARY 4
1 EINLEITUNG 7
1.1 BEDEUTUNG DER MALARIA 7
1.2 LEBENSZYKLUS VON PLASMODIEN 8
1.3 PATHOPHYSIOLOGIE EINER MALARIAINFEKTION 10
1.4 PATHOGENITAETSMECHANISMEN BEI
PLASMODIUM FALCIPARUM UND PLASMODIUM VIVAX:
ZYTOADHAERENZ UND ANTIGENVARIATION 13
1.5 ORGANISATION DER CHROMOSOMENENDEN VON
P. FALCIPARUM: SITZ DER ANTIGENE 16
1.6 ZIEL DER ARBEIT 18
2 ERGEBNISSE 20
2.1 ANALYSE DER REKOMBINATIONSHAEUFIGKEIT VON VAR-GENEN BEI
PLASMODIUM FALCIPARUM
WAEHREND DER MEIOSE , 20
2.1.1 GENERIERUNG VON DBL-A- UND DBL-Y-SPEZIFISCHEN GENSONDEN 20
2.1.2 UNTERSUCHUNG DER FILIALGENERATION 1 AUS DER KREUZUNG ZWISCHEN DD2
UND HB3
AUF T RANSLOKATIONSEREIGNISSE 27
2.1.3 UNTERSUCHUNG DER FILIALGENERATION 1 AUF REKOMBINATIONSEREIGNISSE
INNERHALB
VON VAR-GENEN DURCH DEN VERGLEICH DER HYBRIDISIERUNGSMUSTER ZWEIER
DISTINKTER MARKER 30
2.1.4 ANALYSE DER FILIALGENERATION 1 MITTELS RESTRIKTIONSVERDAU 32
2.2 CHARAKTERISIERUNG EINER NEUEN MULTIGENFAMILIE BEI
PLASMODIUM VIVAX 35
3 DISKUSSION 39
4 MATERIAL UND METHODEN
48
BIBLIOGRAFISCHE INFORMATIONEN
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INHALTSVERZEICHNIS
II
4.1 PLASMODIEN STAEMME 48
4.2 YAC-GENBANKEN 48
4.3 OLIGONUKLEOTIDE 48
4.3.1 ALLGEMEINE OLIGONUKLEOTIDE 48
4.3.2 OLIGONUKLEOTIDE FUER
PLASMODIUM FALCIPARUM
49
4.3.3 OLIGONUKLEOTIDE FUER
PLASMODIUM VIVAX
49
4.4 CHROMOSOMENMARKER 50
4.5 KULTUR VON
PLASMODIUM FALCIPARUM 50
4.5.1 KULTIVIERUNG DER PARASITEN 50
4.5.2 EINFRIEREN UND AUFTAUEN DER PARASITEN 51
4.6 HERSTELLUNG VON LICHTMIKROKOPISCHEN PRAEPARATEN 52
4.6.1 GIEMSAFAERBUNG 52
4.7 DNA-PRAEPARATION 53
4.7.1 DNA-ISOLIERUNG 53
4.7.2 ISOLATION UND EINBETTUNG DER DNA IN AGAROSE-BLOECKCHEN 54
4.7.3 ANALYTISCHE PLASMIDPRAEPARATION 55
4.7.4 UV-SPEKTROPHOTOMETRIE 56
4.7.5 ETHANOL-PRAEZIPITATION 56
4.8 AUFTRENNUNG UND ANALYSE VON DNA-FRAGMENTEN 56
4.8.1 STANDARD-AGAROSE-GELELEKTROPHORESE 56
4.8.2 PULSFELDGELELEKTROPHORESE (PFGE) 57
4.8.2.1 PFGE FUER GENOMISCHE DNA VON
PLASMODIUM FALCIPARUM
58
4.8.2.2 PFGE FUER GENOMISCHE DNA VON PLASMODIUM VIVAX
58
4.8.3 ELEKTROELUTION (SALZFALLE) 59
4.8.4 RESTRIKTIONSANALYSE VON DNA IN AGAROSE-BLOECKCHEN 60
4.8.5 VERDAU DER AGAROSE-BLOECKCHEN MIT SS-AGARASE 60
4.9 SOUTHEM-ANALYSE 61
4.9.1 UEBERTRAGUNG
(BLOTTING)
DER DNA AUF NITROZELLULOSE 61
4.9.2 SYNTHESE RADIOAKTIVER DOPPELSTRAENGIGER DNA-PROBEN DURCH PRIMER
EXTENSION 61
4.9.3 HYBRIDISIERUNG VON IMMOBILISIERTEN NUKLEINSAEUREN 62
INHALTSVERZEICHNIS
III
4.9.4 WASCHEN UND AUTORADIOGRAPHIE DER RADIOAKTIVEN MEMBRAN 63
4.9.4.1 HOCH-STRINGENTE BEDINGUNGEN FUER GENOMISCHE DNA-SONDEN 63
4.9.4.2 HOCH-STRINGENTE BEDINGUNGEN FUER DBL-SPEZIFISCHE VAR-GENSONDEN 63
4.9.5 DEHYBRIDISIERUNG (
STRIPPING
) DER MEMBRAN 63
4.10 KLONIERUNG VON DNA-SEQUENZEN IN
ESCHERICHIA COLI 63
4.10.1 LIGATION 63
4.10.2 TRANSFORMATION 64
4.10.2.1 CHEMISCH-KOMPETENTE ZELLEN 64
4.10.2.2 ELEKTRO-KOMPETENTE ZELLEN 64
4.11 DNA-SEQUENZIERUNG 65
4.11.1 DNA-PRAEPARATION 65
4.11.2 DENATURIERUNG DER DNA UND ANHYBRIDISIERUNG DER PRIMER 66
4.11.3 HERSTELLUNG DES POLYACRYLAMIDGELS 67
4.11.4 POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE 67
4.11.5 FIXIERUNG UND AUTORADIOGRAPHIE DES SEQUENZIERGELS 68
4.12 RNA-EXTRAKTION 68
4.12.1 STANDARD-PROTOKOLL 68
4.12.2 TRIZOL-REAGENZ 69
4.13 REVERSE TRANSKRIPTIONS-POLYMERASE-KETTENREAKTION (RT-PCR) 70
4.13.1 REVERSE TRANSKRIPTION 70
4.13.2 POLYMERASE-KETTENREAKTION (PCR) 71
4.13.3 PCR-PROGRAMM ZUR AMPLIFIKATION VON VAR-GENFRAGMENTEN 71
4.14 Y AC-T ECHNOLOGIE 72
4.14.1 DNA-PRAEPARATION VON HEFEKLONEN UND EINBETTUNG IN
AGAROSE-BLOECKCHEN 72
4.14.2 PULSFELDGELELEKTROPHORESE MIT YAC-DNA 73
4.14.3 HYBRIDISIERUNG EINER YAC-GENBANK MIT EINER RADIOAKTIVEN DNA-PROBE
73
4.14.4 WASCHEN UND AUTORADIOGRAPHIE DER FILTER 73
4.14.5 DEHYBRIDISIERUNG
(STRIPPING)
DER FILTER 73
LITERATURVERZEICHNIS 75
ANHANG
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